新型亲和法外泌体提取试剂盒

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS

 

　　MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS采用磷酯酰丝氨酸（PS）亲和Tim4蛋白固化磁珠（PS亲和法）的方法可以简便快捷地提取高纯度的完整外泌体和其他细胞外囊泡（EVs）。如果想要得到更高纯度的外泌体，请使用10,000×g离心后的上清。

　　该试剂盒使用含有EDTA的中性洗脱缓冲液将外泌体完整洗脱下来，所提取的完整外泌体和其他EVs可用于不同实验，包括电镜分析（TEM）、纳米粒子追踪（NTA）分析、投喂实验、分子组成（蛋白质、脂质、核酸等）分析等。

 

◆膜表面磷酯酰丝氨酸（PS）亲和法

　　Tim4蛋白固化磁珠，在金属离子存在的条件下亲和细胞外囊泡表面的磷酯酰丝氨酸（PS），然后使用含有EDTA的洗脱液进行洗脱，捕获高纯度的完整细胞外囊泡

◆优点・特色

 

 

使用新型亲和提取方法

●　通过PS亲和分子回收 ●　低背景值 ●　在中性条件下通过螯合试剂进行温和洗脱 ※　可获得高纯度，完整的外泌体

无需进行超离

●　使用磁珠改进了操作

●　流程优化

※　高重复性

与其他提取方法相比
方法	外囊泡纯度	囊泡状态	可操作性	回收量
PS亲和法	■■■	完整	简便稳定	■■■
超速离心法	■■	完整	简便	■■
聚合物沉淀法	■	完整	简便快捷	■■■■
密度梯度离心法	■■■■	完整	复杂	■■
抗体亲和法	■■■	不完整	简便稳定	■■

样品类型：细胞培养上清、血清、血浆、尿液等。

●　可以纯化高纯度和完整的细胞外囊泡

●　可以从细胞上清液、血清、血浆和尿液中纯化外囊泡

●　重复性高，回收量稳定

●　简易操作（约3.5小时）

●　启用多个样品（无需超速离心）

◆产品列表

产品名称	包装规格		保存条件
MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS	10次 （产品编号：293-77601）	2次 （产品编号：299-77603）	2-10°C
试剂盒成分 (1) 链霉亲和素磁珠 (2)生物素标记的外泌体捕获 (3)外泌体捕获免疫固定缓冲液 (4)外泌体结合增强剂(×500) (5)洗涤缓冲液 (6)外泌体洗脱缓冲液 (7)反应管	<10 次>  600 μL×1 管  100 μL×1 管  35 mL×1 瓶  500 μL×1 管  75 mL×2 瓶  5 mL×1 瓶  22 管	<2 次>  120 μL×1 管  20 μL×1 管  7 mL×1 瓶  100 μL×1 管  30 mL×2 瓶  1 mL×1 瓶  1 管

 *每套试剂盒能完成5次回收实验，即实际使用量为10×5次/Kit与2×5次/Kit

◆案例•应用

从血清、血浆、尿液中提取的细胞外囊泡的分析

从人血清中提取外泌体的产量比较

　　使用该试剂盒，超离法和抗体亲和法提取人血清的外泌体，接着用CD9和CD63抗体进行免疫印迹实验。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Bioscience公司

      抗CD63兔多抗，System Bioscience公司

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果相当于150μL的血清样本。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

从人EDTA血浆中提取外泌体

　　分别从1mL的EDTA血浆、EDTA血浆（超滤更换缓冲液）、人血清中提取外泌体，进行WB检测（抗Flotillin2抗体）。

●　检测抗体

      抗Flotillin-2小鼠单抗（29/Fotillin-2），BD Bioscience公司

●　使用样品量

      各1mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150μL样品量。从100μL提取物中取出15μL，添加5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

从人尿液中提取外泌体的回收量比较

　　1mL人尿液分别通过本试剂盒、聚合物沉淀法、超离法进行外泌体回收，并做免疫印迹（WB）检测（抗CD9抗体）。

●　检测抗体

      抗CD9兔多抗，System Biosciences公司

●　使用样品量

      各1mL

●　免疫印迹（WB）数据

      各样品结果分别对应150μL尿液样品。从100μL提取物中取出15μL，加入5μL的 4×SDS样品缓冲液，全部上样。

 

◆与传统沉淀法的功能比较实验

　　分别用本试剂盒、超离心法和聚合物沉淀法从K562（人慢性骨髓性白血病）细胞培养上清（无血清培养上清或10%Exosome-depleted FBS添加培养基）提取外泌体，分别比较三种方法的外泌体回收量和外泌体纯度。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS【PS亲和法】

　　按照试剂盒的操作说明（反应时间：3小时），从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中提取外泌体。

超速离心法

　　将10mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）进行超离（110,000×g，70min），用TBS缓冲液重悬沉淀物后，再进行超离（110,000×g，70min），回收沉淀部分。

聚合物沉淀法

　　从1mL经过离心处理（10,000×g，30min）的K562细胞培养上清（无血清培养基或10% Exosome-depleted FBS添加培养基※1）中，按照市售的A公司产品的操作说明（静置时间：过夜）提取外泌体。

※1：110,000×g离心2小时，在不吸到沉淀的前提下回收上清。

 

比较提取的外泌体的透射电子显微镜（TEM）分析结果和纳米粒子追踪（NTA）分析结果

　　分别用本试剂盒、超离法、聚合物沉淀法提取外泌体，用NanoSight LM10检测外泌体片段的粒子直径。另外，用最终浓度为2%的多聚甲醛固定提取到的外泌体片段（2~4×10¹⁰ particles），在透射电子显微镜进行分析。

电子显微镜图像 数据提供：金泽大学 医学系 华山教授、大阪大学 iFReC 中井先生

MagCapture™可提取到很多100nm左右的粒子，在透射电子显微镜中也可以确认到很多细胞外囊泡。

 

K562细胞培养上清提取的外泌体回收量和纯度的比较（无血清培养基）

　　用PS亲和法、超离法和聚合物沉淀法从K562 细胞培养上清（无血清培养基）获得样品进行电泳。接着用银染色和WB法（CD63, Flotilin-2和Lamp-1抗体）进行实验。

回收量，不是回收率

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2 小鼠单抗  （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗 （25/Lamp-1），BD Bioscience公司

 

K562细胞培养上清提取外泌体的回收量和纯度的比较（10%FBS-添加培养基）

　　用MagCapture™外泌体提取试剂盒 、超离法和聚合物沉淀法，从K562 细胞培养上清（10% 去外泌体 FBS补充培养基）获得样品进行电泳，用银染法和WB法（CD63、Lamp-1和Flotilin-2抗体）进行实验。同时，对外泌体提取片段进行质谱测定，比较所有测定的多肽中来自K562细胞的人来源多肽的比例（由于添加到细胞培养基的FBS中牛蛋白聚集体是混杂的，所以人来源多肽的比率会下降）。

●　检测抗体

     抗CD63小鼠单抗（MEM-259）

     抗Flotillin-2小鼠单抗 （29/Flotillin-2），BD Bioscience公司

     抗Lamp-1小鼠单抗（25/Lamp-1），BD Bioscience公司

     健康人血清来源的外泌体中提取miRNA和mRNA的回收量比较

实验数据

①运用不同方法提取外泌体并比较从中提取的microRNA和mRNA的回收量

通过超离法和PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

相比超离法，PS亲和法提取所得EVs中的microRNA和mRNA得到更高产量。

②运用不同的RNA提取方法提取microRNA和mRNA的回收量比较

　　运用PS亲和法将EVs从正常人血清中分离，然后使用microRNA提取试剂盒（产品编号295-71701）或基于AGPC法的试剂提取RNA。通过qRT-PCR分析提取的RNA，并比较microRNA (let-7a, miR-16, miR-92a, miR-142-3p)、mRNA (GAPDH, PIK3CB)的Ct值。

对比AGPC法，使用microRNA提取试剂盒更能有效提取PS亲和法纯化所得EVs中的microRNA和mRNA

◆外泌体蛋白质组学分析

<实验内容及结果>

　　分别利用PS亲和法、超离法、聚合物沉淀法，从含10% FBS（不含外泌体）的K562细胞培养上清液中提取外泌体。将提取样品用10%聚丙烯酰胺电泳分离，剪切出全部的蛋白质条带。然后在凝胶内进行消化，用LC-MS对蛋白质进行检测。对上述三种方法提取的外泌体进行蛋白质组合的相关性比较。

比较通过MASS分析鉴定的前10个蛋白质

白色柱：源自外囊泡的人类蛋白质

灰色柱：来自FBS的牛蛋白污染物

红 色：来自外囊泡的标记蛋白

样品：K562细胞培养基（含有10%去除外泌体胎牛血清）

	PS亲和法	超离法	聚合物沉淀法
1	71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因 (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)	补体C3 (Complement C3)
2	膜联蛋白A6 (Annexin A6)	铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1)	α2-巨球蛋 (Alpha-2-macroglobulin)
3	铁转蛋白受体1 (Transferrin receptor protein1)	血清白蛋白 (Serum albumin)	纤连蛋白 (Fibronectin)
4	V-ATP酶A亚基 (V-type proton ATpase catalytic subunit A)	ATP依赖RNA解旋酶 (ATP-dependent RNA helicase A)	血清白蛋白 (Serum albumin)
5	浮舰蛋白-2 (Flotillin-2)	微管蛋白β5 (Tubulin beta-5 chain)	血小板反应蛋白-1 (Thrombospondin-1)
6	程序性细胞死亡6互作蛋白(Programmed cell death 6-interacting protein)	71kDa热休克同源蛋白 (Heat shock cognate 71kDa protein)	补体C4 (Complement C4)
7	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain )	脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthase)	α-1抗蛋白酶 (Alpha-1-antiproteinase)
8	膜联蛋白A1 (Annexin A1)	细胞表面抗原4F2重链 (4F2 cell-surface antigen heavy chain)	载脂蛋白-β-100 (Apolipoprotein-β-100)
9	220kDa激酶D相互作用底物 (Kinase D-interacting substrate of 220kDa)	U5小核核糖核蛋白的解旋酶 (U5 small nuclear ribonucleoprotein helicase)	胎儿血红蛋白亚单位 (Hemoglobin fetal subunit beta)
10	膜联蛋白A2 (Annexin A2)	β4微管蛋白 (Tubulin beta-4B chain)	β5微管蛋白 (Tubulin beta-5 chain)

成对组合相关性比较

 

◆应用数据

Protein Assay BCA Kit检测外泌体的蛋白质浓度

　　Protein Assay BCA Kit是利用二辛可宁酸（BCA）定量检测溶液中的蛋白质浓度的试剂盒，是蛋白质定量检测法中最通用的方法。其原理为，碱性条件下的蛋白质Cu²⁺离子被还原为Cu⁺。Cu⁺与BCA形成络合物，即产生紫色螯合物，蛋白质浓度与紫色螯合物颜色深浅有关，通过测定562nm处的吸光度，并与标准曲线做比照，即可定量溶液中的蛋白质浓度。

利用MagCapture™外泌体提取试剂盒从细胞培养上清液中提取外泌体，通过Protein Assay BCA Kit高灵敏的检测外泌体中蛋白质浓度。

【实验内容及结果】

　　将通过MagCapture™外泌体提取试剂盒提取的25μL外泌体溶液分注于96孔板中，加入 Protein Assay BCA Kit中试剂A和试剂B混合液200μL。之后60℃孵育30分钟，检测560nm吸光度（图1）。结果表明，通过Protein Assay BCA Kit的高灵敏度检测，可测定提取后外泌体中蛋白质浓度。

图1. Protein Assay BCA Kit 检测BSA的检量线和提取的外泌体蛋白质浓度的检测

 

<BCA Assay 操作概要>

由于外泌体蛋白质浓度相当低，因此BCA测定时不要稀释样品。

①    将BSA标准溶液按照250、125、62.5、31.25、15.625μg／mL和空白对照，分别每孔25μL加到96孔板中。

②    分别把提取的外泌体和洗脱缓冲液（空白）按照每孔25μL加入96孔板。

③    把200μL Protein Assay BCA Kit（产品编号：297-73101）的试剂A盒试剂B混合液（A:B=50:1）加入放有样品的孔板中。

④    60℃孵育30分钟

⑤    室温条件下降低孔板温度

⑥    测定560nm的吸光度

 

产品编号	产品名称	包装
297-73101	Protein Assay BCA Kit 蛋白测定试剂盒（二喹啉甲酸）	250次用
015-25613	2 mg/mL Albumin Solution   from Bovine Serum 2mg/mL 牛血清蛋白溶液	1mL×10

 

◆外泌体的标记和Hela细胞导入实验

【实验概要】

用PKH67（Sigma公司）标记MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取的细胞外囊泡， Hela细胞导入确认

<外泌体PKH67标记>

1. MagCapture™ 外泌体提取试剂盒提取外泌体（实验当天从K562细胞培养上清液提取外泌体）

2. 用BCA Assay和NanoSight检测样品的蛋白质浓度和粒子浓度

3. 将相当于5μg*蛋白量的外泌体样品溶液分装至1.5mL管中。

*请配制合适的使用量

4. 将2.0μL的PKH linker溶解在0.25mL的DiluentC中。…4×Dye solution*

*请配制合适的使用量

5. 添加1/3样品量的4×Dye solution至样品中，混合后在室温中孵育5-10分钟。

6. 根据附带的操作说明用PBS平衡Exosome Spin Columns （MW 3000）（Thermo公司）。

7. 将100μL样品分别加入上述平衡后的旋转柱*中，离心（最大添加量：100μL）。

*准备必需的支数。

8. 将外泌体溶液*加入到已经接种好Hela细胞的培养皿中，24小时后用显微镜观察并利用流式细胞仪进行分析。

*根据实验调节外泌体添加量

图1. PKH标记外泌体的细胞捕获观察

从16mL K562培养上清液中超滤浓缩得到4mL培养上清液作为样品，通过PS亲和法提取外泌体。

●      提取的外泌体蛋白质浓度：22.3ng/μL

●      粒子浓度：1.2×10⁸ particles/mL

将上述标记的外泌体溶液全部加入接种好的Hela细胞中，24小时后用荧光显微镜（左）和流式细胞仪（右）检测捕获情况。

Opti-MEM：取相同量用PKH标记后添加到细胞中作为阴性对照。

 

◆细胞培养上清•血清•血浆的预处理操作

　　样品预处理：对样品进行1,200×g离心操作※1。如果要得到更高纯度的外泌体，则按照下述步骤对样品进行10,000×g离心操作※2。

　　下文是细胞培养上清、血清/血浆的预处理方法。其他体液样品的预处理操作，请参考血清/血浆的实验步骤，做适当调整。

更换缓冲液（限制过滤）操作

用50 mL TBS 缓冲液对1 mL 已经经过离心处理的EDTA 血浆样品进行缓冲液更换。

1. 把19 mL TBS 加进VivaSpin20（100K）中。

2. 把1 mL 离心过的EDTA 血浆上清添加在第1. 的VivaSpin20（100K）中，

　混匀。

3. 把第2. 的VivaSpin20（100K）在4℃下进行离心处理。

4. 减少上线的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

5. 4℃下离心处理。

6. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加10 mL TBS 缓冲液。

7. 4℃下离心处理。

8. 减少上面的液体后，在VivaSpin20（100K）中追加11 mL TBS 缓冲液。

9. 4℃下离心处理直至样品液量达到1 mL 以下。

10. 进行提取。

 

◆MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 操作步骤

 

更多应用说明，请点击：

新型亲和性外泌体纯化法与外泌体高灵敏度检测应用

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PS亲合法

　　通过使用T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白域包含蛋白4（Tim4）分离高度纯化的外泌体。Tim4是在巨噬细胞上表达的I型跨膜蛋白，其强烈结合磷酯酰丝氨酸，不仅显示在凋亡细胞上，而且显示在外泌体和微泡。使用Tim4蛋白，其特异性结合显示在外泌体表面上的磷酯酰丝氨酸。因为结合是Ca²⁺依赖性的，完整的外泌体可以通过添加Ca²⁺螯合剂容易地从Tim 4释放。值得注意的是，利用PS亲和法提取的外泌体纯度之高可以用过质谱显示的。还用于从细胞条件培养基沉淀中分离大外泌体和通过ELISA、流式细胞术对外泌体的灵敏定量。这些结果表明通过Tim4蛋白纯化的有用性表征Evs的真正功能。

（Wataru Nakai, Takeshi Yoshida, Diego Diez etl.A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles[J]Nature, Scientific Reports 6, Article number: 33935 (2016). doi:10.1038/srep33935）

和光外泌体提取试剂盒宣传页	Wako外泌体英文版说明书.pdf
成功研发提取高纯度外泌体方法	外泌体提取试剂盒中文说明书

操作流程

样品制备流程（步骤1）

外泌体捕获固定流程（步骤2）

亲和提取流程（步骤3—5）

外泌体提取血浆样品前处理步骤

使用TBS缓冲液进行缓冲液交换

1、向VIVASPIN 20（100K）中添加19mL TBS缓冲液。

2、将1ml血浆添加到（步骤1）的VIVASPIN 20（100K）中并混合。

3、离心（步骤2）中的VIVASPIN 20（100K）。 （离心条件参考使用说明书）

4、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤3）的VIVASPIN 20（100K）中。

5、离心。

6、当上层液体下降时，添加10mL TBS缓冲液到（步骤5）的VIVASPIN 20（100K）中。

7、离心。

8、当上层液体下降时，添加11mL TBS缓冲液到（步骤7）的VIVASPIN 20（100K）中。

9、离心VIVASPIN 20（100K），直到样品体积变为1mL。

该方案共计使用50mL的TBS缓冲液。

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒

常见问题

•　关于试剂盒的规范、性能

Q1　本试剂盒使用了抗体吗？

Ａ1　没有使用抗体。使用了与金属离子结合和与磷酯酰丝氨酸（PS）结合的蛋白。

 

Q2　用此款试剂盒可提取什么样的细胞外囊泡呢？

Ａ2　外泌体和大型细胞外囊泡（微小泡）。

Q3　外泌体和微泡的区别是？

Ａ3　外泌体，是来源于晚期胞内体，直径为40-100nm的细胞外囊泡。微泡来源于细胞膜，直径100-1000nm的细

　     胞外囊泡。

 

Q4　外泌体和微泡能可以分别纯化吗？

Ａ4　可以。同时纯化的情况下，1200×g离心取上清液。纯化外泌体的情况下，10000×g离心取上清液。只纯化微

         泡的情况下，10000×g离心，沉淀置于TBS制成悬浊液备用。样品的前处理请参考操作说明书。

 

Q5　外壳型病毒也能回收吗？

A5　能。外壳性病毒膜表面也有PS，混入外壳性病毒的样品，所有PS都能回收。需要分离的情况下，使用本试剂盒

        回收后，需要用与病毒或者外泌体特异性抗原的抗体纯化。

 

Q6　所有的外泌体都会暴露磷脂酰丝氨酸（PS）吗？

A6　尚未得到实验验证。通过分析外泌体的膜脂成分证实，有几种细胞（小鼠少突胶质细胞）来源于外泌体。因

        此，不会暴露PS。另一方面有可能存在少量PS暴露的外泌体，而此款试剂不能纯化这种外泌体。但是，使用

        该试剂纯化到的外泌体，已确认有多个外泌体标记蛋白，与以单一类型的表面标记蛋白作为抗原的传统亲和方

        法相比，以膜脂成分为抗原的该试剂能取得更多种类的外泌体。另外，虽然识别表面标记蛋白的抗体可能无法

        识别不同动物来源的抗原，但是该试剂能解决这一问题（人类、小鼠、牛等都能应用）。而且已验证了可以纯

        化超速离心时需沉淀才能回收的外泌体。

 

Q7　该试剂盒的样品是什么？

A7　使用细胞培养上层清液、血清或尿液效果显著。如果血浆中添加了螯合剂（比如EDTA）和柠檬酸，原理上无

        法分离外泌体。若要回收，可通过超滤更换缓冲液来回收。具体步骤请看相关资料。由于肝素处理过的血浆回

        收率低，从血液样本中回收请使用血清。另外有客户成功从血浆、脑脊髓液中回收外泌体。

 

Q8　一次能回收多少外泌体？

A8　根据样品的种类和数量有很大的差异，据研究所实验记录，在一次的分离中最多能回收30μg蛋白质（通过

        BCA法检测）、1-2×10¹⁰粒子（通过纳米技术检测）。（K562培养基中的莫能菌素能促进外泌体分泌，可取

        5mL培养上清液进行回收）。

        1 mL正常人混合血清能回收5×10⁹颗粒（通过纳米技术检测）。

 

•　与传统法的比较

Q9　与超速离心法相比好处在哪？

A9　与超速离心法相比，本试剂盒能更简便、重复性好、高效地回收高纯度外泌体。也能回收超速离心法无法沉淀

        的外泌体。

 

Q10　与传统抗体亲和法相比，PS亲和的优势是什么？

A10　采用传统的抗体亲和法是用变性剂进行洗脱，此款试剂盒是在中性环境下用螯合剂来洗脱的，能完整回收外

          泌体，不会混入非特异性吸附物，能获得高纯度外泌体，提取纯度更高。传统的抗体亲和法只能特异性识别

          一种外泌体表面Marker蛋白质，而本试剂盒是特异性识别膜脂质成分，更能广泛获得外泌体。有事例表明识

          别表面Marker蛋白质抗体不能识别不同动物物种的抗原，而本试剂盒能在大范围的动物物种中运用（人，

          小鼠，牛等都有报道）。

 

Q11　与其他方法相比回收的纯度如何？

A11　与传统沉淀法（超速离心法、多聚物沉淀法）相比，纯度更高。与超速离心法和密度梯度离心法相结合的方

          法相比，能简便地获得同等高纯度的外泌体。（原因：采用抗体的传统亲和法是用变性剂进行洗脱，因此很

          容易混入粒子等非特异性吸附物。然而此款试剂盒是用螯合剂来洗脱的，所以难以混入非特异性吸附物。）

 

Q12　与其他方法相比回收率如何？

A12　与采用抗体的传统亲和法、超速离心法相比，能获得更高的回收率（低于聚合物沉淀法）。

 

•　关于试剂盒的操作方法、组成

Q13　操作该试剂盒耗时多久？

A13　（1个小时预处理样品），该试剂盒Exosome Capture磁珠的固定需要15分钟，然后3个小时的化学反应，

           最后15分钟洗脱，总计3小时30分钟。

 

Q14　本试剂盒需要特别慎重的操作吗？

A14　Exosome Capture固定化磁珠与样品反应后的清洗步骤中最后需要去除洗净液。完全去除后再进行提取。

          提取时在提取液中加入磁珠后，确保磁珠不发生凝集并处于悬浮状态。

 

Q15　提取液的组成有哪些？

A15　是含有1mM的螯合剂、盐、防腐剂的Tris基础溶液。若以上成分阻碍后续分析，请使用超速离心膜

         （Sartorius公司  VivaSpin500，使用100K分子量截留，Code：VS0141）并替换合适的Buffer。

 

Q16　Exosome Capture 固定后磁珠可以循环利用吗？

A16　可以。为了能够高效回收样品中的外泌体，试剂盒可完成5次回收实验。试剂盒里的缓冲液只含5次纯化的

          量。1mL体积以上样本建议进行浓缩后再回收，纯化时可进行反复抽提，提高纯化效率。详情参考操作说

          明书。

 

Q17　Exosome Capture固定化磁珠能保存吗？

A17　可以。洗脱出外泌体后的磁珠需再使用，用试剂盒附带的 Washing buffer或自制的TBS冷藏保存。

 

Q18　实验要留到第二天需要做什么步骤？

A18　Exosome Capture固定化磁珠与样品的反应步骤（反应时间3小时）可以过夜（置于4℃下）。

 

•　关于样品用量

Q19　样品纯化所需的最低量是？

A19　使用旋转器的需要500μL以上，使用离心管混合器的需要100μL。样品量更少的情况下加TBS到所需最低量后

          再使用Exosome Capture固定化磁珠。

 

Q20　大量的样品能回收吗？

A20　可浓缩后再回收。如果样品是培养上清，可以从体积50毫升的样品中回收外泌体。离心分离预处理后，取

          50mL上清液超离浓缩至1mL（推荐Sartorius Viva Spin20 使用100K分子量截留、Code：VS2041）。无

          血清培养基和添加了10% FBS的培养基也可以收集外泌体。详情参照操作说明书。因为血清样品无法浓缩，

          最多只能用10ｍL的样品。但是大于1mL的血清回收率低，建议反复提纯。

 

•　关于外泌体提取后的分析

Q21　外泌体中含有什么？

A21　含有蛋白质、脂质、核酸（DNA、microRNA、mRNA）等。

 

Q22　提取后的细胞外囊泡可以用什么方法检测？

A22　因为能得到完整的细胞外囊泡，可以使用所有的分析方法。

         （例）蛋白质分析：蛋白质电泳、免疫印迹、质谱分析、流式细胞术、ELISA等

      核酸分析如：定量PCR、微阵列（生物芯片）、新一代测序等

      粒子分析：电镜分析，纳米位点分析（NTA）等

      功能分析：体内外的用药实验等

 

Q23　提取后的细胞外囊泡（EVs）能直接添加到细胞使用中吗？

A23　可以使用，但有需要注意的地方。如果提取液的成分有影响，参考Q15替换合适的Buffer。使用离心过滤

          部件。

         （Millipore公司ΜLtrafree – MC， GV 0.22μm 已灭菌、Code：UFC30GV0S）除菌。

 

Q24　电镜分析需要外泌体的量是多少？

A24　能用电镜观察到2-4×10¹⁰的粒子（通过纳米技术检测）。

 

Q25　提取出的细胞外囊泡的保存条件是？

A25　冷藏、冷冻保存。长期保存需要放到-80℃。

          为避免冻结溶解，冻结保存推荐细分后保存。

 

Q26　如何做回收的外泌体提取液的免疫印迹？

A26　本公司研究所从回收的100 μL提取液抽取15 μL，加入5 μL 4×SDS样品Buffer，共20μL的样品全量上样进行

          SDS-PAGE。用量与宣传册上的免疫印迹的样本量一致。

Q27　Exosome质谱检测的步骤是？

A27　外泌体提取→SDS-PAGE与胶内酶切→通过LC-MC/MS进行蛋白质组学分析

 

•　关于外泌体标记

Q28　用该试剂盒提取出来的囊泡怎么判断是外泌体呢？

A28　根据表面抗原的抗体（WB）、电子显微镜、密度梯度离心、纳米粒度测量（如NanoSight LM10）等来

          验证。

Q29　外泌体分离后用免疫印迹法确认的标记蛋白是什么？

A29　CD9， CD63， CD81， Frotillin-2， Lamp-1等。

 

•　相关产品

Q30　有在销售和光检测外泌体用的抗体吗？

A30　本公司当前销售以下抗体。

          Anti CD9 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M01-50UL）

          Anti CD81 for Exosome Isolation（Cosmo Bio Cat. NO.CAC-SHI-EXO-M03-50UL）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.012-27063）

          Anti CD63, Monoclonal Antibody (3-13)（Wako Cat. NO.016-27061）

 

Q31　有可以从分离囊泡里提纯RNA的试剂盒吗？

A31　有。可使用microRNA Extractor SP Kit（295-71701）比AGPC法更能高效提纯RNA。

 

Q32　有销售磁支架吗？

A32　有的。Wako品牌，产品编号290-35591，MagCapture系列磁珠捕获用磁力架。”

 

Q33　该技术专利是什么？

A33　已申请PCT专利。

Q34　加入什么金属离子？

A34　钙离子

 

Q35　血浆提取方法是？

A35　请查看相关资料。

Q36　试剂盒中的22支反应管有什么特殊之处吗？用普通的1.5mL离心管可以吗？

A36　该试剂盒中的反应管使用特殊材质，可减少磁珠吸附，该反应管可单卖

A36　BMBio BM-15 Ring Lock Tube 1.7mL 500 tubes/box 1。

[1]	W. Nakai, et al, Sci Rep 6, 33935 (2016).  A novel affinity-based method for the isolation of highly purified extracellular vesicles. PMID: 27659060
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[11]	M. Santiana, et al., Cell Host & Microbe 24, 208–220 (2018). Vesicle-Cloaked Virus Clusters Are Optimal Units for Inter-organismal Viral Transmission. PMID: 30092198

Ampdirect^® Gene Amplification

新型PCR 扩增缓冲液

　　——无需抽提DNA，直接PCR 扩增！

　　Ampdirect^® Gene Amplification 是一款新开发的PCR 缓冲液，可有效降低PCR 反应体系里的蛋白质、糖类等各种PCR 抑制物对PCR 扩增的影响。应用广泛，适合对昆虫、植物、微生物、土壤、血液、石蜡切片等各类样品直接进行PCR 扩增。

◆优势

　　●省时省力省钱

　　　　无需DNA 抽提，直接进行PCR 反应，节省时间

　　●适用于微量样品

　　　　因为不需要DNA 抽提，不会产生样品损失，故此最适用于微量样品

　　●热启动酶

　　　　厂家自行开发的高性能聚合酶BIOTAQ ™

　　●支持后续实验操作

　　　　扩增产物可用于后续的测序和RFLP 等片段分析

◆实验流程

◆原理

◆示例

　　注：动物样本，比如血液和黏膜细胞等可以直接加入PCR 反应液，不需消化处理。固体样本，比如植物和动物组织需要在含有SDS 和蛋白酶K 的消化液中处理后再进行PCR 反应，或者使用FTA 卡收

集植物组织中的DNA，取带有DNA 的FTA 卡加入PCR 反应液进行PCR 反应。

◆其他应用：

　　●血清中病毒检出

　　●小鼠尾巴裂解液检测基因分型

　　●植物、血液/ 滤纸血液、土壤

　　●昆虫、石蜡切片等微量样品

　　其他应用的详细内容请看相关资料！

相关资料

◆Ampdirect 推荐使用酶与不推荐使用酶

◆其他应用

Ampdiret 相关的FAQ

◆有关样品以及样品前处理

1．　采集后长期保存的血液作为模板，能进行PCR 吗？

　　实验证明，采集后冻存了长达五年时间的血或纸血（干燥血）作为模板，依然能进行PCR。必须长期稳定保存血液时，可使用Whatman 公司的FTA Card（核酸保存用卡）进行保存。关于血液（全血）对PCR 的抑制作用，直接采集的血液（新鲜血）对PCR 抑制作用更强。

　　另外，长久以来的经验证明，采用干燥血作为PCR 模板时，对比用一般的实验纸保存，使用FTACard 保存的血液进行PCR 的结果更稳定，因此推荐使用FTA Card 保存的血作为PCR 模板。

2．　从粪便中抽提的DNA 模板，可用PCR 检测出细菌吗？

　　粪便抽提的DNA 对PCR 有抑制作用，因此用稀释后的DNA 反应。从粪便样品中简便进行PCR 的应用例子，在“使用实时PCR 法高灵敏度检测Vero Toxin”中有介绍。将10%的粪便悬浊液热处理（95℃，5 分钟）后，将离心后的上清液作为PCR 模板。实验证明，使用这个方法，大部分的粪便样品都能稳定进行PCR。

3．　Ampdirect 可应用于RT-PCR 吗？粪便里存在的RNA 病毒也可以检测出来吗？

　　从粪便样品中简便检测RNA 病毒的应用例子，可见“粪便中的RNA 病毒检测”。将粪便悬浊液离心后的上清液，涂布在Whatman 公司的FTA Card（核酸保存用卡）上，干燥后，在卡上打（φ1.25mm）就可作为模板使用。

　　Ampdirect Plus 可做为逆转录反应的反应液，逆转录酶选用的是Invitrogen 公司的M-MLVReverse Transcriptase（Cat No. 28025-013）。

4．　样品的溶解处理最后步骤要在95℃，进行5 分钟的热处理，这个热处理步骤是必须的吗？

　　因为要使溶解液中的Proteinase K 失活，所以必须热处理。如果不进行热处理，Proteinase K 仍保持活性的话，在往PCR 反应液里加入溶解液时，Proteinase K 会将PCR 酶（Taq DNA Polymerase）降解掉，从而不能进行稳定的PCR。实际上，这是从大部分得不到目的PCR 产物的例子上取得的经验。所以，必须在最后对溶解液进行热处理（95℃，5 分钟）。

5．　从植物的叶片抽提的DNA 作为PCR 模板进行反应，但得不到目的PCR 产物。考虑到是植物里所含的糖类抑制了PCR，使用Ampdirect 可以改善这个情况吗？

　　至今为止，已有非常多客户反映，从实验植物、谷物、蔬菜、果蔬的叶片取样，用Ampdirect进行PCR，都取得了良好的结果。不同植物对PCR 的抑制作用也不尽相同，可参照“从植物取样的简便PCR 实例”。在PCR 前用溶解液进行前处理。如担心因为PCR 被抑制而得不到目的PCR 产物，用溶解处理液稀释5~10 倍，会对此情况有很大改善。

6．　小鼠尾部用溶解液溶解了大约1 个小时，还没完全溶解。可作为PCR 的模板使用吗？

　　将小鼠尾巴1~5mm 浸入100μL 溶解液内，55℃下溶解约1 小时后，如小鼠尾巴还未完全溶解，对Proteinase K 进行失活处理（95℃，5 分钟）后，从溶解液中提取出来的DNA 量（拷贝

数）应该足以作为PCR 模板，大部分情况下进行PCR 没有问题。

　　与此对照，如果是将大条的小鼠尾巴（5mm 以上）过夜处理以至完全溶解，溶解液会变成高粘度状态。这种情况下，过剩的DNA 反而会抑制PCR 反应，请用蒸馏水或TE 将溶解液稀释10 倍左右。请注意尽量不要让小鼠尾巴过度溶解。

　　另外，溶解处理后的溶解液不需离心，只需取上清液就可作为PCR 模板使用。从以往经验得知，经溶解处理过的溶解液在冷藏保存条件下保存2~3 年内皆可作为PCR 模板使用。

7．　不对唾液进行前处理就直接作为PCR 模板是不可行的吧？“取样自口腔粘膜的PCR”这个应用，是对口腔黏膜细胞用溶解液进行溶解处理，如果是用唾液的话，也必须用溶解液进行溶解处理吗？

　　目前，也有不少客户为了检测唾液中的微生物，不进行前处理，直接将唾液当成PCR 模板使用。当作为模板进入PCR 反应液的唾液中（数μL）有大量微生物，可获得良好的PCR 产物。与之相反，若微生物数量较少，根据唾液中的蛋白等物质对PCR 抑制的不同程度，有可能得不到稳定的PCR 产物。因此，推荐对溶液用溶解液进行溶解处理，再作为PCR 模板。对唾液进行了溶解处理的话，可得到以下两种结果，①“抽提微生物的DNA”和②“降低唾液对PCR 的抑制作用（分解唾液中的蛋白）”，也可得到稳定的PCR 结果。

8．　如何用PCR 检测血浆、血清样品中的微生物？

　　血浆、血清这些全血，对PCR 有较强抑制作用，所以不能将全血直接用作PCR 模板。因此，要用于“检测血清中的病毒”时，将血浆、血清用溶解液进行溶解处理，分解掉血浆、血清中的蛋白，降低对PCR 的抑制作用。

　　请注意，本方法适用于检测DNA 病毒、细菌，不可用于检测RNA 病毒。检测RNA 病毒时，在溶解处理步骤，因为血浆、血清中存在RNA 分解酶，从病毒外壳裸露出来的RNA 就会被分解。

9、使用FTA Card 和实验纸作为模板进行多样品PCR 时，因为使用打孔器等工具可能会引起污染。有没有相应的对策呢？

　　采集血液样品时，首次打孔取样后，在下一次取样前，用打孔器在FTA Card 或实验纸上没有血样的空白处空打3 个孔，这样可保证打孔器上不会残留前一样品的模板（血样是白血球DNA）。因为从客户处得知，“每次用打孔器取样时，用金伯利（Kimwipe）浸渍酒精擦拭打孔器的打孔部分，这个方法反而引起污染”，所以推荐空打孔的方法。但是，检测拷贝数多的DNA，如线粒体DNA 和质粒DNA 等时，本方法不能防止污染。

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样品：土豆     

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样品：魚類（鲤鱼）、DNA病毒        

     

Plant Physiol. 2009 Dec;151(4):2046-57.

・    The phytochrome-interacting factor PIF7 negatively regulates DREB1 expression under circadian control in Arabidopsis.

　    Kidokoro S, et al.

样品：植物（拟南芥）              

  

Divers. Distrib. 15 (6), 917-927 (2009)

・    Chloroplast DNA phylogeography of the endangered Japanese red maple (Acer pycnanthum): the spatial configuration of wetlands shapes genetic diversity.

　    Saeki I, et al.

样品：植物（枫树）           

 

Indian Journal of Science and Technology Vol.2 No. 10 (Oct 2009)

・    Development of activated sludge adapted to high concentrations of phenol and enhancement of its phenol removal ability by addition of a processed lignite.

　    Ohtsuki T, et al.

样品：活性汚泥        

分析手法：PCR-DGGE法         

 

Mol Ecol. 2009 Dec;18(23):4904-11.

・    Hybridization involving independent gametophytes in the Vandenboschia radicans complex (Hymenophyllaceae): a new perspective on the distribution of fern hybrids.

　    Ebihara A, et al.

样品：植物（蕨类）     

分析手法：PCR-SSCP法          

  

Appl Physiol Nutr Metab. 2009 Oct;34(5):926-32.

・    Is there a gender difference between ACE gene and race distance?

　    Min SK, et al.

样品：人 口腔粘膜細胞            

 

Int J Sports Med. 2009 Sep;30(9):691-4.

・    The cartilage intermediate layer protein gene is associated with lumbar disc degeneration in collegiate judokas.

　    Min SK, et al.

样品：人口腔粘膜細胞              

 

Biosci Biotechnol Biochem. 2009 Nov;73(11):2452-9.

・    Genome-wide identification, structure and expression studies, and mutant collection of 22 early nodulin-like protein genes in Arabidopsis.

　    Mashiguchi K, et al.

样品：植物（拟南芥）              

 

Plant Biotechnology 26(4), 435-441, 2009

・    Modification of the surface carbohydrate composition of tobacco protoplasts transformed with the human UDP-galactose transporter gene hUGT1

　    Horibe T, et al.

样品：植物（烟草）           

  

Genes Brain Behav. 2009 Oct;8(7):650-60.

・    A spontaneous mutation of the Wwox gene and audiogenic seizures in rats with lethal dwarfism and epilepsy.

　    Suzuki H, et al.

样品：大鼠           

 

J Plant Res 2009; 122: 585-95

・    Genetic population structure of Osmunda japonica, rheophilous Osmunda lancea and their hybrids

　    Yatabe Y, et al.

样品：植物           

 

Am J Physiol Renal Physiol 2009; 297: F671-8

・    Npt2a and Npt2c in mice play distinct and synergistic roles in inorganic phosphate metabolism and skeletal development

　    Segawa H, et al.

样品：小鼠           

 

J Immunol 2009;183: 3053-63

・    Crucial contribution of thymic Sirp alpha+ conventional dendritic cells to central tolerance against blood-borne antigens in a CCR2-dependent manner

　    Baba T, et al.

样品：小鼠           

  

J Nat Med 2009; 63: 340-4

・    The botanical origin of kratom (Mitragyna speciosa; Rubiaceae) available as abused drugs in the Japanese markets

　    Maruyama T, et al.

样品：植物         

分析手法：PCR-RFLP法          

 

Emerg Infect Dis 2009;15: 912-5

・    Bartonella quintana in body lice and head lice from homeless persons, San Francisco, California, USA

　    Bonilla DL, et al.

样品：虱子、細菌              

  

Plant Cell Physiol 2009; 50: 1579-86

・    Arabidopsis bile acid:sodium symporter family protein 5 is involved in methionine-derived glucosinolate biosynthesis

　    Sawada Y, et al.

样品：植物（拟南芥）              

 

Mol Genet Metab 2009; 97: 190-5

・    High frequency of acid alpha-glucosidase pseudodeficiency complicates newborn screening for glycogen storage disease type II in the Japanese population

　    Kumamoto S, et al.

样品：滤纸血        

分析手法：ARMS-PCR法         

 

Laboratory Animal research 2009; 25: 75-8

・    Simple Genotyping Method Using Ampdirect Plus and FTA Technologies: Application to the Identification of Transgenic Animals and Their Routine Genetic Monitoring

　    Nakanishi S, et al.

样品：小鼠-大鼠、FTA card              　

 

Int. J. Environ. Res. Public Health 2009; 6: 999-1009

・    Association between a Polymorphism of Aminolevulinate Dehydrogenase (ALAD) Gene and Blood Lead Levels in Japanese Subjects

　    Miyaki K, et al.

样品：人全血              

 

Jpn J Infect Dis 2009; 62: 164-7

・    Direct Colony PCR of Several Medically Important Fungi using Ampdirect(R) Plus

　    Alshahni MM, et al.

样品：真菌（酵母・霉菌）              

 

Biochem. Eng J 2009; 45: 76-81

・    Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent

PCR-DGGE method

　    Kuang Y, et al.

样品：牛乳、細菌     

分析手法：PCR-DGGE法          　

 

Lab Chip 2009; 9: 1052-8

・    Microfluidic device using chemiluminescence and a DNA-arrayed thin film transistor photosensor for single nucleotide polymorphism genotyping of PCR amplicons from whole blood

　    Hatakeyama K, et al.

样品：人全血      

分析手法：PCR-RFLP法          

 

Cancer Cell 2009; 15: 195-206

・    Cancer metastasis is accelerated through immunosuppression during Snail-induced EMT of cancer cells

　    Kudo-Saito C, et al.

 

Vet Microbiol 2009; 135: 261-6

・    Detection of cyprinid herpesvirus 3 DNA in river water during and after an outbreak

　    Minamoto T, et al.

样品：河川水、DNA病毒         

 

Methods Mol Biol 2009; 538: 7-27

・    Backtracking of leukemic clones to birth

　    Wiemels J, et al.

样品：新生儿滤纸血           

 

Int J Plant Sci 2009; 170: 237-46

・    Phylogenetic relationship and morphology of Dalzellia gracilis (Podostemaceae, subfamily Tristichoideae)

with proposal of a new genus

　    Koi S, et al.

样品：植物           

 

Infect Dis Clin Pract 2008; 16: 230-4

・    Association of the SLC11A1 Gene Polymorphisms With Susceptibility to Micobacterium Infections in a Japanese Population

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J Vet Diagn Invest 2008; 20: 68-71

・    Molecular screening of canine GM1 gangliosidosis using blood smear specimens after prolonged storage:

detection of carriers among shiba dogs in northern Japan

　    Yamato O, et al.

 

Biosci Biotechnol Biochem 2008; 72: 2831-9

・    Diversity and Similarity of Microbial Communities in Petroleum Crude Oils Produced in Asia

　    Yamane K, et al.

 

Vector Borne Zoonotic Dis 2008; 8: 565-73

・    Detection of Trypanosoma brucei in field-captured tsetse flies and identification of host species fed on by the infected flies

　    Konnai S, et al.

 

J. Pestic Sci 2008; 33: 122-7

・    Environmental distribution and novel high-throughput screening of APEO-degrading bacteria using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-MS)

　    Ichiki Y, et al.

 

Zootaxa 2008; 1746: 15-38

・    Molecular systematics and biogeography of the genus Zizina(Lepidoptera: Lycaenidae)

　    Yago M, et al.

 

Extremophiles 2008; 12: 519-27

・    Phylogenetic and enzymatic diversity of deep subseafloor aerobic microorganisms in organics- and methane-rich sediments off Shimokita Peninsula

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Principles and Technical Aspects of PCR Amplification

・    pp91-101, Springer Netherlands, 2008

　    Elizabeth van Pelt-Verkuil, et al.

 

Zoolog Sci 2008; 25: 838-42

・  Phylogenetic Position of the Endemic Large Carpenter Bee of the Ogasawara Islands, Xylocopa ogasawarensis (Matsumura, 1912) (Hymenoptera: Apidae), Inferred from Four Genes

　    Kawazoe K, et al.

 

Mol Phylogenet Evol 2008; 49: 503-13

・    Redundant species, cryptic host-associated divergence, and secondary shift in Sennertia mites (Acari: Chaetodactylidae) associated with four large carpenter bees (Hymenoptera: Apidae: Xylocopa) in the Japanese island arc

　    Kawazoe K, et al.

 

Odonatologica 2008; 37: 131-44

・    Population genetic differentiaiton in three sympatric damselfly species in a highly fragmented urban landscape

　    Sato M, et al.

 

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・    NOTCH1 mutation can be an early, prenatal genetic event in T-ALL

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Res Vet Sci 2007; 82: 54-60

・    Nonsense mutation of feline beta-hexosaminidase beta-subunit (HEXB) gene causing Sandhoff disease in a family of Japanese domestic cats

　    Kanae Y, et al.

 

Leuk Res 2007; 31: 1633-40

・    Regulatory polymorphisms of multidrug resistance 1 (MDR1) gene are associated with the development of childhood acute lymphoblastic leukemia

　    Hattori H, et al.

 

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・    Plasma levels of unactivated thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) are down-regulated in young

adult women: analysis of a normal Japanese population

　    Akatsu H, et al.

    

Am J Botany 2007; 94: 1630-41

・    Cryptic species and host specificity in the ectomycorrhizal genus Strobilomyces (Strobilomycetaceae)

　    Sato H, et al.

 

Botanical Journal of the Linnean Society 2007; 155, 1-27

・    A global molecular phylogeny of the fern genus Trichomanes (Hymenophyllaceae) with special reference to stem anatomy

　    Ebihara A, et al.

 

Trop Anim Health Prod 2007; 39: 369-74

・    Comparison of polymerase chain reaction methods for the detection of Theileria equi infection using whole blood compared with pre-extracted DNA samples as PCR templates

　    Alhassan A, et al.

  

Am J Trop Med Hyg 2007; 77: 324-9

・    Establishment of a mass screening method of sand fly vectors for Leishmania infection by molecular biological methods.

　    Kato H, et al

 

Metabolism 2006; 55: 751-7

・    G-protein beta 3 subunit polymorphism C1429T and low-density lipoprotein receptor-related protein 5 polymorphism A1330V are risk factors for hypercholesterolemia in Japanese males–a prospective study over 5 years

　    Suwazono Y, et al.

   

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・    Sequence variation of bovine prion protein gene in Japanese cattle (Holstein and Japanese Black)

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Ann Hum Genet 2006; 70: 767-77

・    G-protein beta3 subunit variant C825T is a risk factor for hypertension in Japanese females -a prospective cohort study over 5 years

　    Suwazono Y, et al.

  

J Biosci Bioeng 2006; 102: 572-4

・    High-throughput genotyping of filamentous fungus Aspergillus oryzae based on colony direct polymerase chain reaction.

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・    The molecular phylogeny of the genus Rhizopus based on rDNA sequences.

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・    Molecular detection of epiphytic Acaryochloris spp. on marine macroalgae.

　    Ohkubo S, et al

 

Tohoku J Exp Med 2006; 209: 149-57

・    G-protein beta3 subunit gene variant is unlikely to have a significant influence on serum uric acid level in Japanese workers.

　    Suwazono Y, et al

 

Ornithol Sci 2006; 5: 139-143

・    Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing.

　    Arima H, et al

 

Int J Mol Med 2006; 17: 77-82

・    The -1438A/G polymorphism in the 5-hydroxytryptamine receptor 2A gene is related to hyperuricemia, increased gamma-glutamyl transpeptidase and decreased high-density lipoprotein cholesterol level in the Japanese population: a prospective cohort study over 5 years.

　    Suwazono Y, et al

 

Arch Virol 2005; 150: 1927-31

・    Rotavirus antigenemia in children with encephalopathy accompanied by rotavirus gastroenteritis

　    Nakagomi T, et al.

    

Thromb Res 2005; 115: 191-7

・    Factor XII Shizuoka, a novel mutation (Ala392Thr) identified and characterized in a patient with congenital coagulation factor XII deficiency

　    Oguchi S, et al.

     

Hemoglobin 2005; 29: 1-10

・     Hb KOCHI [beta141(H19)Leu–>Val (g.1404C–>G); 144-146(HC1-3)Lys-Tyr-His –>0 (g.1413 A–>T)]: a new variant with increased oxygen affinity

　    Miyazaki A, et al.

    

J Epidemiol 2005; 15: 203-10

・     Increased risk of obesity resulting from the interaction between high energy intake and the Trp64Arg polymorphism of the beta3-adrenergic receptor gene in healthy Japanese men.

　    Miyaki K, et al

     

Br J Pharmacol 2005; 145: 818-28

・     Inhibition of the antigen-induced activation of rodent mast cells by putative Janus kinase 3 inhibitors WHI-P131 and WHI-P154 in a Janus kinase 3-independent manner.

　    Watchara Linwong, et al

      

Blood Coagul Fibrinolysis 2004; 15: 367-73

・    Genetic analyses and expression studies identified a novel mutation (W486C) as a molecular basis of congenital coagulation factor XII deficiency

　    Ishii K, et al.

    

Genes Chromosomes Cancer 2004; 39: 335-40

・    Protracted postnatal natural histories in childhood leukemia

　    Maia AT, et al.

   

Obes Res 2004; 12: 4-8

・     Lack of association between human G-protein beta3 subunit variant and overweight in Japanese workers.

　    Suwazono Y, et al

  

Drug Matab. Pharmacokin. 2004; 19: 303-7

・    Genotyping of single nucleotide polymorphism (SNPs) influencing drug response by competitive allele-specific short oligonucleotide hybridization (CASSOH) with immunochromatographic strip.

　    Hiratsuka M, et al

   

J Vet Diagn Invest 2004; 16: 469-72

・    Rapid and simple mutation screening of GM1 gangliosidosis in Shiba dogs by direct amplification of deoxyribonucleic acid from various forms of canine whole-blood specimens.

　    Yamato O, et al

 

      

Blood Coagul Fibrinolysis 2003; 14: 663-70

・    Association of the -159 C –> T polymorphism in the CD14 promoter with variations in serum lipoproteins in healthy subjects.

　    Eilertsen KE, et al.

   

GENES, Chromosomes & Cancer 2003; 37: 36-43

・    Prenatal origin of TEL-AMLI-positive acute lymphoblastic leukemia in children born in California.

　    McHale CM, et al

      

Arch Virol 2002; 147: 2187-95

・    Molecular characterization of serotype G2 and G3 human rotavirus strains that have an apparently identical electropherotype of the short RNA pattern

　    Nakagomi T, et al.

   

BLOOD；2002；99：3801-5

・    In utero origin of t(8;21) AML1-ETO translocations in childhood acute myeloid leukemia

　    Wiemels JL, et al

   

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 15101-6

・    Site-specific translocation and evidence of postnatal origin of the t(1;19) E2A-PBX1 fusion in childhood acute lymphoblastic leukemia.

　    Wiemels JL, et al

  

Clin Lab; 2002; 48: 377-84

・    Various applications of direct PCR using blood samples

　    Nishimura N, et al

     

Proceedings of the Seventh International Colloquium on Paratuberculosis; 2002; 267-9

・    Efficiency of polymerase chain reaction using a novel method of DNA preparation and amplification for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine fecal samples

　    Kojima K, et al

     

Arch Virol 2001; 146: 557-70

・    Direct evidence for genome segment reassortment between concurrently-circulating human rotavirus strains

　    Watanabe M, et al.

   

Transfusion 2000; 40: 1081-7

・    Elimination of both cell-free and cell-associated HIV infectivity in plasma by a filtration/methylene blue photoinactivation system

　    Abe H, et al.

     

Microbiol Immunol 2000; 44: 957-61

・    Apparent re-emergence of serotype G9 in 1995 among rotaviruses recovered from Japanese children hospitalized with acute gastroenteritis

　    Oka T, et al

   

J Clin Microbiol 2000; 38: 2649-54

・    Major change in the predominant type of “Norwalk-like viruses” in outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis in Osaka city, Japan, between April 1996 and March 1999

　    Iritani N, et al

   

Blood; 2000; 96:264-8

・    Detection of clonotypic IGH and TCR rearrangements in the neonatal blood spots of infants and children with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia

　    Yagi T, et al

     

Ann Clin Biochem; 2000; 37: 674-80

・    Direct PCR from whole blood without DNA isolation

　    Nishimura N, et al

     

Stroke 2000; 31: 2661-4

・    Polymorphism in the promoter of lipopolysaccharide receptor CD14 and ischemic cerebrovascular disease

　    Ito D, et al

  

Stroke 2000; 31: 936-9

・     C242T polymorphism of NADPH oxidase p22 PHOX gene and ischemic cerebrovascular disease in the Japanese population

　    Ito D, et al

  

Stroke 2000; 31: 493-7

・    Association between platelet glycoprotein Iba genotype and ischemic cerebrovascular disease

　    Sonoda A, et al

可用于iPS细胞的冷冻保存！

培养细胞冻存液COS banker系列

　　COS banker是不含血清和牛来源化合物的安全培养细胞冻存液。

　　COS banker II是为了保存过继免疫淋巴细胞而开发的淋巴细胞冻存液。

 

◆特点

●　可以冷冻保存iPS细胞。

●　无需稀释使用。

●　复苏后的细胞存活率优异。

●　"COS banker"不含动物的血清以及其他动物源成分。^＊1

●　为了防止其中的DMSO腐蚀PET容器，特意采用玻璃装瓶。

*1  "COS banker II"含有GMP级人血清白蛋白的稳定剂。

 

◆实验步骤

1.    以转速1200rpm/5min对处于对数期^*2的细胞进行离心操作，然后收集大约5×10⁵~1×10⁷个离心后的细胞。

2.    向细胞沉淀中添加1mL本产品，进行重悬后放进冻存管中，在-80°C冷冻保存。

3.    用液氮储存时，细胞请预先在-80°C下冷冻1天以上。

4.    复苏操作请在37°C的恒温水浴锅中快速进行。

*2 冻存的细胞需位于对数期，这点对于提高复苏后的存活率至关重要。

 

◆规格

产品名称	COS banker	COS banker II
产品编号	COS-CFM01	COS-CFM02
产品包装	120mL	120mL
成分	含DMSO（含量不公开）  不含血清	含DMSO（含量不公开） 含人血清白蛋白 不含血清
储存方法	低温避光保存（2~8°C）	低温避光保存（2~8°C）
有效期	生产后2年	生产后2年

◆质量控制

检查项目	测试方法	标准
无菌性	TGC、SCD以及培养法（日本药典）	不生长
内毒素	动力学比色法（日本药典）	0.3 EU/ｍL 以下
细胞保存性	冷冻7天后重新复苏的细胞生存	与对照冻存液相同

◆使用例子

COS banker	iPS细胞（Dotcom）、
	Daudi（人伯基特淋巴瘤）、HeLa S3（人宫颈癌）、
	K562（人慢性骨髓性白血病）、Raji（人伯基特淋巴瘤）、
	MOLT-4（人急性淋巴细胞白血病 : T- 细胞）、
	CTLL-2（小鼠T : IL-2 依赖性）、NIH/3T3（小鼠胎儿）、
	PC-12（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤）、CHO-K1（中国仓鼠卵巢）、
	Vero细胞（非洲绿猴肾来源细胞株）、
	MDCK细胞（犬肾小管上皮细胞来源的细胞株）
	MCF-7（人乳癌） 、HepG2（人肝癌）、
	P3U1（小鼠骨髓瘤）、成纤维细胞、
	表皮角化细胞、血管内皮细胞、杂交瘤、SF9（昆虫细胞）
COS   banker II	人末梢血来源活化淋巴细胞、
	Daudi细胞、Raji细胞、K652细胞、
	Molt-4F细胞、CTLL-2细胞、MCF-7（人乳癌）、
	HepG2（人肝癌）、P3U1（小鼠骨髓瘤）、
	成纤维细胞、表皮角质形成细胞、血管内皮细胞、
	杂交瘤、CHO细胞（中国仓鼠卵巢来源细胞株）、
	MDCK细胞（犬肾小管上皮细胞来源的细胞株）、HeLa（人宫颈癌）、SF9（昆虫细胞）

◆iPS细胞

【冷冻保存程序（缓慢冻结法）】

●　用CTK溶液回收细胞

●　离心（1000rpm，5分钟），除去上清液

●　添加COS banker，重悬细胞

●　分装到冻存管中

●　将冻存管放入冻存盒中。

●　置于-80℃的超低温冰箱中

●　次日将冻存管移至液氮中

图1 iPS细胞（Dotcom）的冻存结果

左：复苏后第二天、   右：复苏后第六天

 

◆人淋巴细胞

图2 （左图）不同细胞冻存液的细胞存活率比较

添加0.5mL细胞（活细胞浓度 3×10⁶ cells/mL）至冻存管，并储存在-80°C中。一周/一个月/两个月后复苏（在37°C恒温水槽中孵育90秒，剩余的冷冻细胞摇晃融解），测量存活率。

灰：一周后、 蓝：一个月后、 黑：2个月后

 

图3（右图）复苏后的细胞增殖情况

复苏冻存了一周的淋巴细胞，将各个培养基的活细胞浓度调至20×104cells/mL，在水浴锅中培养。对第5天及第6天的活细胞进行计数。

◆产品列表

COS banker

不含血清和牛来源化合物的安全培养细胞冻存液。

产品编号	制造商	产品名称	包装
COS-CFM01	KOJ	COS banker [Cell Freezing Medium] (chemical defined) COS banker [细胞冻存液] （化学成分明确）	120mL

COS banker II

为了保存过继免疫淋巴细胞而开发的淋巴细胞冻存液。

产品编号	制造商	产品名称	包装
COS-CFM02	KOJ	COS banker II [Cell Freezing Medium] COS banker II [细胞冻存液]	120mL

弱臭硫化合物

     有机合成化学中有机硫化合物是重要的反应剂。最常用的乙硫醇、苄硫醇、苯硫醇、二甲硫醚等都是低沸点且具有硫特有的恶臭。这些问题不仅会导致实验操作环境  恶劣，也会引起大气污染。因此我们开发了有机硫反应剂的无臭替代品¹⁾。
 这次介绍的是能用于Swern氧化和Corey-Kim氧化的降低恶臭的有机硫反应剂^{2) 3)}。同时，苯环中插入TMS (Trimethylsilyl) 基的硫醇化合物也能降低恶臭，作为弱臭  硫反应剂被使用⁴⁾。

 

◆反应例子

Swern Oxidation

Corey-Kim Oxidation

Michael addition and protodesilylation

 

 

 

［1］西出喜代治、野出學：有機合成化学協会誌, 62, 39 (2004).

［2］Nishide, K., Ohsugi, S., Fudesaka, M., Kodama, S., Node, M.: Tetrahedron Lett., 43, 5177 (2002).

［3］Ohsugi, S., Nishide, K., Oono, K., Okuyama, K., Fudesaka, M., Kodama, S., Node, M.: Tetrahedron59, 8393 (2003).

［4］Nishide, K., Miyamoto, T., Kumar, K., Ohsugi, S., Node, M.: Tetrahedron Lett. 43, 8569 (2002).