Bis(benzo-15-crown-5)

11 イオン電極用試薬

Bis(benzo-15-crown-5)

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  B020　 Bis(benzo-15-crown-5)
• CAS番号
  69271-98-3
• 化学名
  Bis[(benzo-15-crowN-5)-4-methyl]pimelate
• 分子式・分子量
  C₃₇H₅₂O₁₄=720.80

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マニュアル

HilyMax

• 分子生物学関連試薬

遺伝子導入試薬

• 製品コード
  H357　 HilyMax

内容物が微量のため確認しづらい場合があります。
内容物の確認についてはこちら

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マニュアル

Q

遺伝子導入後の培地交換は必ず行う必要はありますか？

A

低い細胞毒性と高い導入効率を望まれる場合は、培地交換をお勧めします。
しかし、細胞(例：CHO細胞など)によっては、培地交換が毒性や導入率に影響しないものもありすので、細胞系にあわせて行ってください。

Q

導入効率が悪かった場合、どのような点を検討すれば良いでしょうか？ (DNA量,HilyMax量,複合体形成比,時間など)

A

＜細胞毒性が低い＞

　導入効率が極端に低い場合は、DNA量を増やすか、DNA(μg):HilyMax(μL)=1:5～1:9にしてみてください。

　高い導入効率を示す場合があります。

＜細胞毒性が高い＞

　DNA量またはHilyMax量を減らしてください。

Q

説明書には、保存条件が『冷蔵』と『冷凍』の2つの記載があります。 どのように保存すればよいのでしょうか？ 最初から『冷凍』したり、ずっと『冷蔵』ではダメですか？

A

未開封・未使用の場合には『冷蔵保存』、試薬を緩衝液と混合し溶解した後は『冷凍保存』してください。
未開封の状態で『冷凍保存』いただいても品質には問題はありませが、使用時に凍結した[Lipoform Buffer]を融解していただく必要があります。

また、溶解後に関しては、2～3週間以内に使い切る場合であれば『冷蔵保存』いただいても性能に影響はありません。数週間を越える使用の場合には、必ず『冷凍保存』してください。

Bis(12-crown-4)

11 イオン電極用試薬

Bis(12-crown-4)

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  B021　 Bis(12-crown-4)
• CAS番号
  80403-59-4
• 化学名
  Bis[(12-crowN-4)methyl] 2-dodecyl-2-methylmalonate
• 分子式・分子量
  C₃₄H₆₂O₁₂=662.85

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マニュアル

Cell Counting Kit-8

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cell Counting Kit-8

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞毒性

細胞増殖/細胞毒性アッセイキット

• 製品コード
  CK04　 Cell Counting Kit-8

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マニュアル

Q

カタログや説明書には96 wellプレートでの測定例が示してありますが、 24 wellや12 wellのプレートで測定を行うことができますか？ その場合には試薬(Cell Counting Kit)の添加量はどのようにすれば良いでしょうか？

A

96wellプレート以外でも測定できます。

試薬の添加量は使用培地の10分の1を目安にして下さい。
(1 mLであれば試薬を100 μL など）

細胞数などにより、試薬の添加量を少なくして測定できる可能性もありますが、最初は10分の１量を目安として検討されることをお勧めします。

Q

Cell Counting Kit-8とCell Counting Kit-Fの違いは何ですか？

A

Cell Counting Kit-8は細胞内酵素活性を指標とし、比色測定を行います。

【Cell Counting Kit-8】
色素：WST-8
形態：1ボトル

Cell Counting Kit-Fは蛍光での測定となります。
細胞内エステラーゼ活性を指標に蛍光測定を行います。
比色法よりも少ない細胞数から測定出来ます。（50 cells/well 以上）

【Cell Counting Kit-F】
色素：Calcein-AM
形態：1ボトル
 

• 製品別に細胞増殖および毒性試験法の特徴を一覧表で比較しています 細胞増殖／細胞毒性測定試薬ガイド

Q

Cell Counting Kit-8とMTTの違いは何でしょうか？

A

細胞の酵素により、テトラゾリウムがホルマザンになるというのは共通したところです。
それぞれの違いとしては

【Cell Counting Kit-8】
生成するホルマザンが水溶性である。（溶解操作が不要）
測定波長：400～450 nm
細胞全体の酵素活性を反映している。
生成するホルマザンは細胞毒性がない。
細胞が生きたまま測定できる。

【MTT】
生成するホルマザンが非水溶性である。（有機溶媒等による溶解が必要）
測定波長：550～600 nm
主にミトコンドリアの酵素活性を反映している。
生成するホルマザンが細胞毒性を示す。
細胞を溶かさないと測定できない。

有機溶媒によるホルマザン溶解が必要な分、MTTの方が操作が煩雑になります。
 

• 製品別に細胞増殖および毒性試験法の特徴を一覧表で比較しています 細胞増殖／細胞毒性測定試薬ガイド

Q

ブランク試験を行うとしたらどのような条件で吸光度を測定すればよいでしょうか？ （細胞単独、細胞＋培地、培地のみ、いずれも無し　etc.)

A

ブランクとして確認するのは3種類の考え方があります。

①細胞＋培地にて600 nm以上で測定する。
→細胞を含む培地の測定試料に濁りがある場合に測定します。
濁りによる散乱が測定誤差となるためで、全波長領域で高くなります。試薬の吸収がない600 nm以上で測定します。しかし、濁りがない、殆ど無視できる程度の濁りであれば、測定する必要はありません。

②細胞＋培地にて450 nm(測定波長)を測定する。
→細胞を含む培地の測定試料に試薬の発色と同じ吸収がある場合に測定します。
450 nmの吸収ですので、試料の着色で判断できます。着色がなければ必要はありません。

③培地＋試薬(CCK)にて450 nm(測定波長)を測定する。
→細胞を含まない培地に試薬を添加した場合の吸収を測定するもので、一般的な試薬ブランクです。
培地に還元性物質が含まれると、試薬が発色します。そのような発色がないことを確認します。
発色が僅かであれば、ブランクとして差し引いてもよいです。しかし、発色が強いようであれば培地中の還元物質を除くか、別の培地をご検討下さい。
また、薬物添加試験を行われるのであれば、添加する薬物で発色しないかを確認してください。

＊ブランクとして大きく出てくるのは②の培地に着色がある場合と③の試薬の誤発色です。
　これらをご確認ください。

Q

前培養をするように取扱説明書に指示されていますが、これは必要なものですか？

A

付着細胞では前培養を推奨しております。
トリプシン処理等により培養用フラスコから回収する際に、細胞はダメージを受けます。
そのため、対数増殖期の状態にために細胞の前培養が必要になります。

浮遊細胞の場合は省略しても構いません。

Q

Cell Counting Kit-8の発色に阻害を与えるような物質はなんですか？

A

一般的に還元物質（アスコルビン酸など）が共存していると正誤差が生じます。

フェノールレッドや血清は問題ありません。
フェノールレッドの場合、若干（5％程度）のブランク上昇がみられますが、使用上は問題ありません。

しかし、発色に阻害を与える培地成分が含まれているかもしれませんので、ご使用の培地が誤発色を与えないかご確認の上、ご使用ください。（薬剤も同様です）

また薬剤によっては細胞の機能に影響を与えるものがあるようで、細胞の増殖能は止まっていても酵素活性を働かせたりしていると（タンパク合成を行なったり）発色を起こしたりします。

負誤差の要因としては、特にこの物質が影響があるといわれているものはないのですが、上記と逆で、薬剤により影響を受け、実際には増殖しているのに発色が低く出る
という現象が起ることはあるようです。また、酸化剤も発色を阻害し負誤差を与える要因となることがあります。

Q

細胞数は変わらないのに吸光度が上昇します。どのような要因が考えられますか。

A

以下の要因が考えられます。

(1)還元物質の影響　　　　　　　　　　　　
(2)細胞当たりの代謝活性の変化　　　

詳細は下記をご確認下さい。

—————————————————————————————————————————————-
(1)還元物質の影響について

  　 試料や被験物質に還元性を持つ物質が存在する場合、Cell Counting Kit-8に含まれるWST-8を直接還元し誤発色することがあります。

　　細胞が無い系で、Cell Counting Kit-8を添加し、発色の有無を予めご確認ください。
　　発色する場合は、Cell Counting Kit-8を添加する前に培地交換を行ってください。

　　その他発色に影響を与える因子については、
　　よくある質問「Cell Counting Kit-8の発色に阻害を与えるような物質はなんですか？」をご確認ください。
—————————————————————————————————————————————-
(2)細胞当たりの代謝活性の変化について

　細胞当たりの代謝活性が上昇した場合、細胞数が変わらなくても、吸光度が上昇することがあります。

　Cell Counting Kit-8は生細胞の脱水素酵素の活性を指標としています。
　そのため、細胞数の変化がなくても、細胞の代謝活性が変化した場合に吸光度が変化する可能性があります。

　細胞の代謝活性の変化の有無は、別の指標で生細胞を測定^*1したり、細胞の代謝産物^＊2を確認することで
　複合的に評価される場合があります。下記リンク先の資料もご参考ください。

　*1:細胞増殖／細胞毒性測定用試薬の選択ガイド

　*2:細胞内代謝測定
—————————————————————————————————————————————-
 ご不明点がありましたら、小社カスタマーサポートまでお問合せください。
 (free dial:0120-489548 / E-mail:info@dojindo.co.jp)

Q

呈色反応を途中で止めたい(測定までに時間が空く)のですが、どうすれば反応を止められますか？

A

Cell Counting Kitの発色機構は細胞内に存在する脱水素酵素に依存しているので、
呈色反応を止めるには、この酵素反応を止める為に細胞を死滅させます。

下記のいずれかの方法で反応停止を行ってください(添加量は96wellの場合)
反応停止後は24時間以内に測定して下さい。

(1)1 w/v% SDSを10 μL添加する。
　　*SDSを添加する場合には、泡立たないように注意して下さい。
　　 表面に泡があると光散乱して吸光度が高くなります。
　　
(2)0.1 mol/ HClを10 μL添加する。
　　*もし、緩衝能の高い培地をご使用の場合には、もっと濃い酸を添加してください。
　　 アルカリ溶液による反応停止では定量が出来ません。
　　 反応液をアルカリ性にすると、生成したホルマザン色素が青変し、定量性が失われます。

Q

450 nm 以外のフィルターは使用できますか？

A

430-490 nm のフィルターが使用できますが、450 nm のフィルターをご使用いただきますと最も高感度に測定できます。

　　　参考)WST-8ホルマザンの吸収スペクトル

Q

Cell Counting Kit-8の保存期間を教えてください。

A

キット溶液は4℃で12ヶ月安定です。遮光して冷蔵にて保管してください。

長期保存の際は、遮光し-20℃で保存してください。

凍結-融解操作はなるべく行わないで下さい。

＊容器をプラスチック容器に変更いたしました。（以前はガラス容器）それに伴い、安定性試験を再度行い冷蔵での長期安定性が確認出来ましたので保管条件を変更しております。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

Cell Counting Kit-F

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cell Counting Kit-F

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞毒性

細胞増殖/細胞毒性アッセイキット

• 製品コード
  CK06　 Cell Counting Kit-F

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

51Cr-release法とCell Couting Kit-Fとの相関はありますか？

A

Cell Couting Kit-Fとしての相関は確認していませんが、
蛍光試薬として用いているCalcein-AMと51Cr-release法との相関の報告はございます。

N.G.Papadopoulos, et.al., J.Immunol.Methods, 177,101-111(1994)

Q

Cell Counting KitとCell Counting Kit-8、Cell Counting Kit-Fの違いは何ですか？

A

Cell Counting KitとCell Counting Kit-8は、発色色素が違いますが基本的な原理は同じです。
細胞内酵素活性を指標とし、比色測定を行います。
また、Cell Counting Kit-8は、Cell Counting Kitと比較して、「感度が高い」、「試薬安定性が高い」と利点があります。

Cell Counting Kit-Fは蛍光での測定となります。細胞内エステラーゼ活性を指標に蛍光測定を行います。
比色法よりも少ない細胞数から測定出来ます。

各製品で使用される色素と形態は以下の通りです。
　【Cell Counting Kit】
　　色素：　WST-1
　　形態：　2ボトル

　【Cell Counting Kit-8】
　　色素：WST-8
　　形態：1ボトル

　【Cell Counting Kit-F】
　　色素：Calcein-AM
　　形態：1ボトル

Q

通常の透明な培養プレートでも測定出来ますか？

A

白か黒のプレートを使用してください。

透明な培養プレートでは測定時の照射した光が散乱してしまい、正確な測定が行えません。
正確な測定を行うためにも、白色及び黒色の蛍光用プレートの御使用をお薦めします。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

–Cellstain®- AO solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain®- AO solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

核染色用色素

• 製品コード
  A430　 –Cellstain®- AO solution
• CAS番号
  65-61-2(AO)
• 化学名
  3,6-Bis(dimethylamino)acridine, hydrochloride, solution
• 分子式・分子量
  C₁₇H₂₀ClN₃=301.81

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。

蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。
【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

AOの使用方法を教えて下さい。

A

下記に一例を示します。
*細胞の種類、観察条件により濃度や固定の検討が必要です。

○HeLa細胞を用いた細胞染色
①AO 1 mgを純水 1 mLに溶解し、ストック溶液とする。
②ストック溶液10 μLをPBS緩衝液5 mLで希釈する。(AOは約6 μmol/Lとなる）
③HeLa細胞をトリプシン-EDTAなどで回収し、細胞の懸濁液を準備する。
④この細胞懸濁液を遠心分離する。（1000 rpm, 3 min)
上清を除き、PBSを添加し、ピペッティングで十分分散させる。
（この時、細胞数が10⁵～10⁶ cells/mLになるように調整する）
⑤1.5 mlマイクロチューブに④で得た細胞懸濁液30 μLを添加する。
⑥これに②のAO溶液15 μLを添加し、37℃で15分インキュベートする。
⑦カバーガラス上に⑥の溶液10 μLをのせ、上からもう１枚カバーガラスを重ねる。
⑧このカバーガラスを蛍光顕微鏡に置き観察する。
蛍光特性：λ_ex=502 nm, λ_em=526 nm(dsDNA)、λ_ex=460 nm, λ_em=650 nm(ssDNA)

○未固定細胞のDNA-RNAの同時染色の例
・Z.Darynkiewicz, Methods Cell Biol.,33,285(1990)より
①Detergent溶液を調整する。保存は4℃以下で行なう。
Triton X-100(100 μL), 1.0 mol/L HCl(8 mL), NaCl(877 mg)を純水に溶解し100 mLとする。
最終濃度はそれぞれ0.1%, 0.08 mol/L, 150 mmol/L となる。

②色素溶液を調整する。保存は4℃以下で行なう。
1)100 mmol/Lクエン酸(37 mL)と200 mmol/L Na₂HPO₄(63 mL)を混和し、100 mLの溶液を作成する。
2)NaCl(877 mg)を加えて溶解する。
3)EDTA・2Na(34 mg)を加えて溶解する。
4)AO stock solution(1 mg/mL in H₂O)600 μLを加える。
＊最終濃度は、AO:20 μmol/L, EDTA・2Na:1 mmol/L, NaCl:150 mmol/L

③検体溶液(2×10⁵ cells/mL以下）200 μLにdetergent溶液400 μLを加え、
氷浴中に15秒静置する。不要な細胞の分解を防ぐ為に、検体倍地中に
血清を10～20％(v/v)含む方が望ましい。

④氷水で冷却した色素溶液1.2mLを加え、その後3～15分の間に測定を行なう。

⑤フローサイトメトリーで測定する。
励起波長は488 nmを使用。蛍光フィルターとして520-580 nm(dsDNA), 620 nm(RNA,ssDNA)
などのバンドパスフィルターを使用する。
蛍光特性：λ_ex=502 nm, λ_em=526 nm(dsDNA)、λ_ex=460 nm, λ_em=650 nm(ssDNA)

Bisthiourea-1

11 イオン電極用試薬

Bisthiourea-1

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  B432　 Bisthiourea-1
• CAS番号
  187404-67-7
• 化学名
  2,7-Di-tert-butyl-9,9-dimethyl-4,5-bis(N’-n-butylthioureido)xanthene
• 分子式・分子量
  C₃₃H₅₀N₄OS₂=582.91

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マニュアル

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞毒性

細胞毒性測定キット

• 優れたコストパフォーマンス
• 冷蔵で6ヶ月保存可能なWorking Solution
• 1つのキットで、ホモジニアス測定、ノンホモジニアス測定の選択が可能

• 製品コード
  CK12　 Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST

<お知らせ>
　取扱説明書を改訂しました。(2022/01/18）

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

技術や使用製品に関する補足

• 

  細胞増殖/細胞毒性アッセイキット
  Cell Counting Kit-8

• 

  生細胞・死細胞測定キットセット
  Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

技術や使用製品に関する補足

• 

  細胞内代謝測定キット

  NADP/NADPH Assay Kit-WST

• 

  グルタチオン測定キット

  GSSG/GSH Quantification Kit

• 

  代謝と疾患の関連性を示した報告例

  これからはじめる細胞内代謝

Q

490 nm以外の吸収フィルターで測定できますか？

A

弊社では490 nmを推奨していますが、490±2-3 nm程度の違いは問題ありません。490 nm以外では、450 nmのフィルターは弊社でも使用実績があり、使用可能です。但し、吸光度値は490 nmと比較し高くなります。

Q

毒性試験でCell Counting Kit-8との相関性はありますか？

A

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTとCell Counting Kit-8では、測定原理が異なるために必ずしも相関性は得られません。そのため、細胞毒性試験の場合には、遊離LDH測定法とCell Counting Kit-8など数種の指標で測定いただくことをお勧めします。
・Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST：細胞膜の損傷により培地中に漏れ出したLDH活性を測定（細胞膜損傷が指標）
・Cell Counting Kit-8：細胞内の代謝活性（デヒドロゲナーゼ）を測定（代謝活性が指標）

Q

LD50値が過去の測定値と大きく異なります。なにか対処法はありますか？

A

・細胞の状態によって、被験物質による影響の受け方が変わりLD50値に影響します。ご使用になる細胞は、継代条件や継代回数をコントロールし、可能な限り同じ状態の細胞をお使い下さい。
・被験物質の希釈系列を調製する際の希釈倍率を狭くすることで、より信頼性の高いLD50値を導き出すことができます。
下記の要領で、使用する被験物質濃度を設定されることをおすすめします。

検討の流れ

① 被検物質が利用できる最高濃度を基準に10倍希釈を繰り返し、5-6桁程度の広い検体濃度域で毒性試験を実施する。[図①]
（①の操作で、毒性が現れる濃度域の予測最高濃度の目安をつける）
② ①の結果から、その被検物質の濃度が現れる濃度の予測最高濃度（100%致死を生じる最低濃度）を基準に2倍希釈を繰り返し、2-3桁をカバーする濃度域で毒性試験をする。[図②]
③ ②の手順を繰り返し、最終的に細胞毒性が20-80%の間に少なくとも検体濃度が3点以上プロットできる濃度域を設定する。[図③]

Q

LDHのアイソザイムの測り分けはできますか？

A

本製品は、トータルのLDH活性を指標とした細胞毒性測定用となりますので、LDH1, LDH2, LDH3等の活性の測り分けはできません。

Q

LDHはどの程度安定ですか？

A

以下のような報告例があります。
培地中でのLDH活性の低下は1日で5%以下(文献1)、また、冷蔵保存では約1週間は安定と報告されています（文献2）。なお、安定性は評価条件等により変化する可能性があります。
ご理解の上、下記論文をご参考ください。

文献1：
A. Wagner, A. Marc, JM. Engasser, A. Einsele, "The use of lactate dehydrogenase (LDH) release kinetics for the evaluation of death and growth of mammalian cells in perfusion reactors.", Biotechnol Bioeng. 1992; 39, (3), :320..
文献2：
M. Allen, P. Millett, E. Dawes, N. Rushton., "Lactate dehydrogenase activity as a rapid and sensitive test for the quantification of cell numbers in vitro.", Clin Mater. 1994; 16, (4), 189.

Q

Cytotoxicity LDH Assay Kit-WSTにLDH標準品は入っていますか？

A

細胞毒性試験用のため、LDH標準品は同梱しておりません。LDH活性も測定する場合は、別途、お買い求めください。

Q

Stop solution添加後すぐに測定する必要はありますか？

A

Stop solution添加後、3時間以内に測定してください。その場合は、プレートを遮光してください。

Q

ウェル間でバラツキが多いのですが何が原因でしょうか？

A

以下の要因が考えられますので、ご確認ください。

①培地の表面に気泡が発生している。

以下の方法で気泡を除去してください。
・シリンジや注射針の先端で、気泡を除去してください。
・（96wellプレート用遠心機をお持ちの場合）1,000 x g, 1分間遠心してください。

②インキュベーション中に培地の水分が蒸発して試薬濃度が変化している。

マイクロプレートの一番外側のウェルは、インキュベーション中の水分蒸発が起こりやすいため、長時間インキュベーションする場合は、一番外側のウェルは測定には利用せず、培地のみを入れて使用してください。

③試薬を添加する際に、最初と最後に添加するウェルの時間差が大きい。

全てのウェルに添加するWorking Solution、Stop Solutionについては、マルチチャンネルピペットのご使用をお勧めします。

④添加した試薬がよく混合されていない。

Lysis Buffer, Working Solution およびStop Solutionを添加した際、プレートミキサーで混合するか、または、プレートの側面を指で軽く叩いて添加した試薬と培地を混和してください。
特に、Lysis Bufferは添加量が少なく、高コントロールの値に影響を与えるため、ご注意ください。
なお、プレートを叩く際は、ウェル中の培地が漏れ出さない程度にしてください。

⑤使用する（マルチチャンネル）ピペットの秤量が正確ではない。

ピペットの秤量が正確か確認してください。

Q

バックグラウンドが高くなりました。原因や対策を教えてください。

A

以下の原因が考えられます。
①培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
②被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。
（なお、一般的なDMEM、RPMI、F-12等の培地には、通常、還元物質は含まれていません）

Q

細胞数最適化時の高コントロールと低コントロールの吸光度の差が小さい

A

①バックグラウンドが高いために低コントロールの吸光度が高くなっている可能性があります。以下を確認してください。

・培地中の血清に含まれるLDHはバックグラウンドを上げます。無血清培地または血清量を5%以下となるように調製した培地をご使用下さい。
・被検物質や培地中に強い還元性を持つ物質が含まれていると、色素WSTが誤発色してバックグラウンドを上げます。試薬ブランクを測定して確認してください。

②高コントロールに生細胞が残っている可能性があります。

Lysis Bufferがウェル内で均一になり細胞が全て死細胞となるように、Lysis Buffer添加後にプレートを軽く振りLysis Bufferが十分に混ざるようにしてください。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

–Cellstain^®– DAPI

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– DAPI

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

死細胞染色色素

• 製品コード
  D212　 –Cellstain^®– DAPI
• CAS番号
  28718-90-3
• 化学名
  4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride
• 分子式・分子量
  C₁₆H₁₇Cl₂N₅=350.25

【注意】-Cellstain^®– DAPIは、通常、チューブ底面にフィルム状に付着した状態となっております。
稀に、輸送中の振動等により本品がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏に付着している場合がございます。内容物を下に落としてから開封をしてご使用ください。
ご不明な点がございましたら、小社カスタマーリレーション部までお問合せください。（Free Dial：0120-489-548）

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

 ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。

【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度がEBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

DAPIを核染色に用いたいのですが、どのように使用すればよいのでしょうか？

A

 下記のような使用報告例がございます。 DAPIストック溶液を作成する場合には、水を使用して下さい（PBSには溶解しにくい）。
ただし、水に溶解したものは長期保存には適していません。
長期保存をお考えの際は、溶液の安定性を高めた溶液タイプの製品-Cellstain^®– DAPI solution（コード：D523）をご使用下さい。 ご使用の際、ストック溶液を緩衝液もしくは有機溶媒にて目的の濃度に希釈して下さい。

【DAPI を用いた細胞染色の例】
固形腫瘍あるいはcluster を含むsample のDAPI 染色の例（参考文献3）
1) 0.02 ％トリプシン – EDTA 処理し、37 ℃で30 分間 incubate 後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。
2) -20 ℃の50 % methanol （ethanol でも可）にて固定後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。
3) -20 ℃の30 % methanol にて洗浄後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。
4) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。
5) RNase の0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）溶液 (1 mg/mL ) を細胞10⁶ 個あたり0.2 mL を加え、37 ℃にて30 分間 incubate する。
6) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。
7) 1 μg/mL のDAPI 溶液10 mL 加え、4 ℃にて２時間遮光の上染色する。

【DAPI を用いた細胞染色の例】 Vollenweider らはリンフォカイン活性化キラ－（LAK）細胞の細胞増殖アッセイにおいて、
　DAPI 染色を行ない、蛍光プレ－トリ－ダ－を用いて測定している(参考文献 ²⁾。
その時の濃度はストック溶液で0.1 mg/mL の水溶液、使用濃度は1 μg/mL のメタノ－ル溶液を用い、
1 well 当たり 100 μL 使用して蛍光染色している。  

【参考文献】
1) W. Schnedl, A.-V. Mikelsaar, M. Breitenbach, O. Dann, Hum. Genet., 36, 167 – 172 (1977).
2) I. Vollenweider, P. Groscurth, J. Immunol. Methods, 149, 133 (1992)).
3) M. A. Hotz, J. Gong, F. Traganos, Z. Darzynkiwicz, Cytometry, 15, 234 – 244 (1994).
4) N. Poulin, A. Harrison, B. Palcic, Cytometry, 16, 227 – 235 (1994).

C14-K22B5

11 イオン電極用試薬

C14-K22B5

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  C391　 C14-K22B5
• 化学名
  4,13-Bis[N-(1-adamantyl)carbamoylacetyl]-8-tetradecyl-1,7,10,16-tetraoxa-4,13-diazacyclooctadecane
• 分子式・分子量
  C₅₂H₈₈N₄O₈=897.28

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

–Cellstain®- DAPI solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain®- DAPI solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

死細胞染色色素

• 製品コード
  D523　 –Cellstain®- DAPI solution
• CAS番号
  28718-90-3(DAPI)
• 化学名
  4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, solution
• 分子式・分子量
  C₁₆H₁₇Cl₂N₅=350.25

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

 ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。
【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

 

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

DAPIを核染色に用いたいのですが、どのように使用すればよいのでしょうか？

A

下記のような使用報告例がございます。
【DAPI を用いた細胞染色の例】
固形腫瘍あるいはcluster を含むsample のDAPI 染色の例（参考文献3）

1) 0.02 ％トリプシン – EDTA 処理し、37 ℃で30 分間 incubate 後、
　　1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。

2) -20 ℃の50 % methanol （ethanol でも可）にて固定後、
　　1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。

3) -20 ℃の30 % methanol にて洗浄後、1,500 rpm で
　　５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。

4) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で
　　５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。

5) RNase の0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）溶液 (1 mg/mL ) を
　　細胞10^6 個あたり0.2 mL を加え、37 ℃にて30 分間 incubate する。

6) 0.2 M リン酸緩衝液（pH 7.2）にて洗浄後、1,500 rpm で５分間遠心分離を行ない、上清をすてる。

7) 1 μg/mL のDAPI 溶液10 mL 加え、4 ℃にて２時間遮光の上染色する。

【DAPI を用いた細胞染色の例】

Vollenweider らはリンフォカイン活性化キラ－（LAK）細胞の細胞増殖アッセイにおいて、
　DAPI 染色を行ない、蛍光プレ－トリ－ダ－を用いて測定している(参考文献 2)。
その時の濃度はストック溶液で0.1 mg/mL の水溶液、使用濃度は1 μg/mL のメタノ－ル溶液を用い、
1 well 当たり 100μL 使用して蛍光染色している。

 

 

【参考文献】
1) W. Schnedl, A.-V. Mikelsaar, M. Breitenbach, O. Dann, Hum. Genet., 36, 167 – 172 (1977).
2) I. Vollenweider, P. Groscurth, J. Immunol. Methods, 149, 133 (1992).
3) M. A. Hotz, J. Gong, F. Traganos, Z. Darzynkiwicz, Cytometry, 15, 234 – 244 (1994).
4) N. Poulin, A. Harrison, B. Palcic, Cytometry, 16, 227 – 235 (1994).
5) C. Souchier, M. French, M. Benchaib, R. Catallo, P. A. Bryon, Cytometry, 20, 203 – 209 (1995).

Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞毒性

細胞増殖/細胞毒性アッセイキット

• 製品コード
  CK17　 Viability/Cytotoxicity Multiplex Assay Kit

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

Dibenzyl-14-crown-4

11 イオン電極用試薬

Dibenzyl-14-crown-4

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  D043　 Dibenzyl-14-crown-4
• CAS番号
  106868-21-7
• 化学名
  6,6-Dibenzyl-1,4,8,11-tetraoxacyclotetradecane
• 分子式・分子量
  C₂₄H₃₂O₄=384.51

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

–Cellstain^®– Hoechst 33258 solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– Hoechst 33258 solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

核染色用色素

• 製品コード
  H341　 –Cellstain^®– Hoechst 33258 solution
• CAS番号
  23491-45-4(Hoechst 33258)
• 化学名
  2′-(4-Hydroxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride, solution
• 分子式・分子量
  C₂₅H₂₇Cl₃N₆O=533.88

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

Hoechst 33258 ,Hoechst 33342 solutionの励起波長、蛍光波長とこれらの違いについて教えて下さい。

A

波長は以下の通りです。
Hoechst33342 Ex:350 nm Em:461 nm
Hoechst33258 Ex:352 nm Em:461 nm

基本的な使用方法は両方とも同じです。
弊社の製品は水溶液になっておりますので、
ご希望の濃度の希釈し、添加して下さい。

この二つの違いですが、基本的にはAdenine-Thymidine部に特異的に結合する薬品です。
生細胞の膜も通過し、生細胞のDNAとも結合します。
膜の透過率はHoechst 33342の方が若干高いです。
Hoechst33258はdsDNA selectivのようです。

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。
【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

Hoechst33258の使用方法を教えてください。

A

 色々な使い方がありますが、一例として形態観察の例を示します。
アポトーシス細胞の核変化(クロマチン凝縮、断片化)を手軽に観察する方法として用いられます。

＜試薬＞

・細胞固定液：1％グルタルアルデヒド/PBS(-)

・蛍光染色液：1 mM Hoechst33258/PBS(-)
　　　*同仁の製品は[1 mg/mL]になっています(約1.87 mmol/L)

＜操作方法＞

1．約1X10⁶個の細胞を含む細胞培養液を400 Xg，5 min遠心し、上清を捨てる。

2. 細胞固定液を100 μL加え、ピペッティング等により混和する。

3. 室温で30 min静置する。

4. 400Xg,5 min遠心し、上清を捨てる。

　　PBS(-)を1 mL加え、ピペッティング等により混和した後、400Xg､5 min遠心し上清を捨てる。

　　（＊このときグルタルアルデヒドをよく洗浄除去する。退色の原因になります）

5. PBS(-)を20 μL加え、混和した後、蛍光染色液を4 μL加え混合する。

6. スライドガラス上に(5)の細胞液を1滴落し、カバーガラスをのせ、端を押さえる。

7. 蛍光顕微鏡下で観察する。

＊細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ「アポトーシス実験プロトコール」田沼靖一監修より

HDOPP-Ca

11 イオン電極用試薬

HDOPP-Ca

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  H003　 HDOPP-Ca
• CAS番号
  52813-66-8
• 化学名
  Bis(4-n-octylphenyl)phosphate, calcium salt
• 分子式・分子量
  C₅₆H₈₄CaO₈P₂=987.29

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞老化

老化細胞検出キット

• 製品コード
  SG03　 Cellular Senescence Detection Kit – SPiDER-βGal

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

技術情報の目次

• 原理
• 蛍光特性（β-galactosidaseと反応後のSPiDER-βGal）
• 本キットを使用した論文
• キットの使用手順
• 特長①．生細胞も固定化細胞も適用できる
• 特長②．定量が容易にできる
• 一般的な老化細胞マーカー
• 異なる老化マーカーとの共染色
• 組織サンプル中のSA-β-gal検出
• T細胞(浮遊細胞)におけるSA-β-gal検出
• 細胞老化と細胞周期との関連性
• 共焦点定量イメージサイトメーターによる定量解析

技術や使用製品に関する補足

• 

  細胞周期測定試薬

  Cell Cycle Assay Solution Blue

• 

  ミトコンドリア膜電位検出キット

  JC-1 MitoMP Detection Kit

Q

1キット当りの使用回数の目安は？

A

目安となる使用回数については、下記の容器毎の数量をご参考ください。

※１ウェル当りに添加する染色溶液の量によって上記の数量は変わります。
　 使用する容器と必要な１ウェル当りの染色溶液量を予め確認の上、ご使用ください。

Q

Bafilomycin A1 を添加する理由を教えて下さい。

A

多くの細胞には内在性のβ-ガラクトシダーゼの存在が知られていますが、SPiDER-βGalは、内在性のβ-ガラクトシダーゼと老化マーカーであるSA-β-Galともに反応するため、老化が認められていない細胞でも、バックグラウンドが高くなり、SA-β-Galの検出に支障が出てきます。
Bafilomycin A1は、リソソーム中のATPase活性を阻害し、リソソーム中のpHを酸性から中性付近に変化させますが、この作用により内在性β-ガラクトシダーゼの活性が低下します。そのため、SPiDER-βGalを添加する前にBafilomycin A1で細胞を処理することで、SPiDER-βGalはSA-β-Galと反応して老化細胞を蛍光染色することができます。

左図ではBafilomycin A1の添加有無によるSA-β-Gal検出の違いを示しています。

なお、Bafilomycin A1は、オートファジー阻害剤としての利用も知られています。ご利用の際は、実験系に支障があるかご検討の上、支障が有る場合は、固定化細胞の利用をお勧めします。固定化細胞を用いる場合は、バッファーで細胞内pHをコントロールするため、Bafilomycin A1 は使用しません。取扱説明書に記載された手順に従って染色することができます。

Q

DMSO stock solutionは、どのくらい安定ですか？

A

SPiDER-βGal DMSO stock solution及びBafilomycin A1 DMSO stock solution調製後は、-20℃保存した場合に1か月間安定であることを確認しています。

Q

Working solutionは、どのくらい安定ですか？

A

SPiDER-βGal working solution及びBafilomycin A1 working solutionは保存できないため、用時調製して下さい。

Q

老化細胞を蛍光観察する際の注意点はありますか？

A

細胞老化が進むと細胞内にリポフスチンと呼ばれる不溶性物質が蓄積してきます。リポフスチンは自家蛍光を発するため蛍光観察時にバックグラウンドとして影響することがあります。その場合、老化細胞中のSA-β-gal活性を正確に評価するために、SPiDER-βGalを添加しない試料もご用意いただき確認することをお勧めします。

○フローサイトメーターの場合
・「老化細胞」および「老化していない細胞」を用いて、各々①②の平均蛍光強度(MFI)を測定してください。
　　　①SPiDER-βGalを添加した細胞
　　　②SPiDER-βGalを添加していない細胞（バックグラウンド）

・「①の平均蛍光強度」から「②の平均蛍光強度」を差し引いてください。
　バックグラウンドを差し引いたSA-β-gal由来の蛍光強度をSA-β-gal活性の指標とします。
　　　a：SA-β-gal活性（老化細胞）　　　　　 = ①の平均蛍光強度　－　②の平均蛍光強度
　　　b：SA-β-gal活性（老化していない細胞） = ①の平均蛍光強度　－　②の平均蛍光強度

・上記の aおよびb の値を比較することで、SA-β-gal活性として評価してください。
   また、上記のaからbを差し引くことで細胞老化に伴うSA-β-gal活性の変化を確認できます。

○蛍光顕微鏡の場合
・初めにSPiDER-βGalを添加していない老化細胞を用いて蛍光観察してください。
・リポフスチン由来の蛍光像（バックグラウンド）が影響を与えない程度に感度（gainなど）を調整してください。
・その後、同じ撮影条件でSPiDER-βGalを添加した細胞や老化していない細胞の蛍光観察を行い評価してください。

Q

細胞を固定化した後に、SA-β-galは染色できますか？

A

可能です。固定化した場合、Bafilomycin A1を用いた細胞の前処理は必要ありませんが、pH6.0に調整したMcIlvain bufferを別途準備して頂く必要があります。詳細は取扱説明書をご覧ください。

Q

固定化細胞をフローサイトメーターを用いて検出するプロトコルを教えて下さい。

A

下記のプロトコルを参照ください。

(1) 細胞を35 mmディッシュに播種し、37℃、5% CO²インキュベーターで一晩培養する。
(2) 培地を吸引除去し、HBSS 2 mlで1回洗浄する。
(3) トリプシンで細胞を剥がし、培地500 μlで回収する。
(4) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(5) 2% PFA/PBS 100 μlに懸濁し、室温で5分間固定する。
(6) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(7) HBSS 500 μLに懸濁し、300×gで5分間遠心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(8) SPiDER-βGal working solution(固定化細胞用) 500 μlを加え、37℃で30分間インキュベートする。
　　 ※pHの変動を抑えるため、5% CO₂インキュベーターは使用しない。
(9) 300×gで5分間遠心し、上澄みを除去する。
(10) HBSS 500 μlに懸濁し、300×gで5分間遠心後、上澄みを除去する。これを2回繰り返す。
(11) HBSS 500 μlを加えて細胞を回収し、フローサイトメーターにて解析する。

Q

細胞を固定化後にSA-β-gal検出および免疫染色はできますか？

A

はい、染色は可能ですが、細胞を固定化するとSA-β-galが低下する可能性があります。 （下記の^※2に注意事項を記載）
以下の実験例を参照しご検討ください。

WI-38細胞を固定化後に、SA-β-gal検出およびγ-H2AX（DNA損傷マーカー）の免疫染色を行った。

＜実験操作＞

(1)	WI-38細胞を35 mm dishに播種し、37℃、5% CO2インキュベーターで一晩培養した。
(2)	培養上清を除き、4% Paraformaldehyde/PBS溶液2 mlを細胞に添加し、室温で3分間インキュベートした※1。
(3)	PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(4)	SPiDER-βGal working solution ※2 2 mlを添加し、37℃で30分間インキュベートした※3。
(5)	PBS 2 mlで細胞を2回洗浄した。
(6)	0.1% Triton X-100/PBS 2 mlを細胞へ添加し、室温で30分間インキュベートした。
(7)	PBS 2 mlで2回洗浄した。
(8)	1% BSA/PBS溶液2 mlを細胞へ添加し、室温で1時間インキュベートした。
(9)	抗γ-H2AX IgG (マウス由来)を1% BSA/PBS溶液にて希釈後、細胞に添加し4℃で一晩インキュベートした。
(10)	PBS 2 mlで細胞を3回洗浄した。
(11)	抗マウスIgG(Cy5標識)を1% BSA/PBSで希釈後、細胞に添加し室温で1時間インキュベートした。
(12)	上清を除き、PBS 2 mlで細胞を2回洗浄し蛍光顕微鏡下で観察した。
※1	固定化時間を長くすると、SA-β-gal活性が低下します。
※2	細胞の固定化操作によりSA-β-gal活性が低下する可能性があります。 もしSA-β-gal評価時に十分な蛍光強度が得られない場合は、SPiDER-βGal DMSO stock solution を500-1000倍に希釈しご使用ください。通常はSPiDER-βGal DMSO stock solutionをMcIlvaine buffer（pH 6.0）にて2,000倍の希釈を推奨。 希釈倍率の異なるSPiDER-βGal working solutionの結果をFig.1に示す。
※3	インキュベートの際は、5% CO2インキュベーターでは行わないこと。5% CO2インキュベーター内に固定化した細胞をおくと、バッファーが酸性になることで内在性のβ-galactosidase活性が上昇することが考えられる。結果として、バックグラウンドが上昇し、老化細胞と若い細胞のSA-β-gal活性の差が見えにくくなる。

 

＜実験データ＞

図1 免染前後におけるSPiDER-βGal染色の蛍光強度変化

免疫染色の前後でSPiDER-βGalの蛍光強度を比較すると、固定化を行う免疫染色の過程でSPiDER-βGalの蛍光強度が低下していることを確認した。
 

図2 希釈倍率の異なるSPiDER-βGalによる染色例（免疫染色後） 　赤： SPiDER-βGal、青： γ-H2AX　＜露光時間: 1.5 sec＞

SPiDER-βGal working solutionの希釈倍率を2000倍から666倍に変更することで、免疫染色（固定化）により低下したSPiDER-βGalの蛍光強度が免疫染色前と同程度の強度を示すことを確認した。

Q

染色後の蛍光が弱くて確認できないのですが、対策を教えてください。

A

下記の3点についてご確認またはご検討ください。

①ご使用のフィルターが試薬の蛍光特性に合致している。
　＜推奨フィルター＞
　　・蛍光顕微鏡：　励起（500-540 nm）, 蛍光（530-570 nm）
　　・フローサイトメーター：　励起（488 nm）, 蛍光（500-540 nm）
　
②各working solutionは用時調製したものを使用する。

③染色時間を長くする。
　SPiDER-βGal working solution添加後、30分間のインキュベーションで蛍光が確認できない場合は、インキュベーション時間を45-60分間を目安にご検討ください。

Q

SA-β-Gal発現細胞を染色後、細胞は固定化できますか？

A

可能です。4%パラホルムアルデヒドを用いて固定化することを推奨します。

Q

培地中の血清やフェノールレッドは検出に影響しますか？

A

培地中の血清およびフェノールレッドは、SA-β-galの検出には影響しません。

Q

老化細胞とコントロール細胞で蛍光強度に差がない場合、何を確認したら良いですか？

A

STEP1:顕微鏡の観察条件を最適化してください。
STEP2:観察条件を最適化しても解決しない場合、染色条件の最適化を行ってください。

—————————————————————————
STEP1＜顕微鏡の観察条件を最適化＞

コントロール細胞の蛍光と老化細胞の蛍光に差が見られない場合下記をご確認ください。

・コントロール細胞を観察し蛍光が僅かに確認できる条件までGain、レーザー強度を下げる、または露光時間を短くする。
(共焦点顕微鏡：Gain、レーザー強度の調整　落射型顕微鏡：露光時間の調整)

・老化細胞の蛍光を観察し、コントロール細胞との蛍光の差を確認する。

・蛍光の差がみられない場合はSTEP2を確認する。

※観察する部分がガラスボトムシャーレの容器をお使いください。

顕微鏡観察条件とコントロールおよび老化細胞の蛍光強度の関係

—————————————————————————
STEP2＜染色条件の最適化＞

細胞によっては、SPiDERの染色時間もしくは濃度の検討が必要な場合がございます。
以下を目安に最適条件をご検討ください。
染色時間：10分～60分
染色濃度：取扱説明書に記載の濃度の1/2量～2倍量

※観察する細胞数が少ないと感度が得られない場合がございます。
　必要に応じて、細胞数の最適化を行ってください。

染色条件とコントロールおよび老化細胞の蛍光強度の関係

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞老化

老化細胞検出キット（マイクロプレート用）

• 製品コード
  SG05　 Cellular Senescence Plate Assay Kit – SPiDER-βGal

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

技術や使用製品に関する補足

本キット使用時の注意点：細胞数の補正をお勧めします。

マイクロプレートを用いた細胞の解析では、得られる結果がウェル中の細胞数によって変化する場合があります。その際には、細胞数のカウントやトータルタンパク質量の確認により、得られた測定値の補正（ノーマライゼーション）が必要となります。本キットでは、試薬を細胞培養液に添加するだけで、細胞内の核を染色し得られる蛍光強度から、細胞数を簡便に評価することができます。
細胞数ノーマライゼーションキットは、
こちらから

Q

1キットあたりの測定可能なサンプル数を教えてください。

A

測定可能なサンプル数の目安は以下の通りです。

	20 tests	100 tests
測定可能なwell数	96 wellプレート 20 well分	96 wellプレート 1 枚分
測定可能なサンプル数 (n=3 にて測定した場合)	6 サンプル	30 サンプル

Q

96 wellプレートで細胞を老化誘導をして測定することは可能ですか？

A

老化誘導はディッシュ等で行い、その後、細胞を96 wellプレートに移して測定することを推奨します。
同一プレート内に老化誘導しない細胞（コントロール）と老化誘導する細胞（サンプル）を配置して比較を行いますが、96 wellプレートで老化誘導を行うと、（老化誘導の日数に依りますが）コントロール細胞は増殖しすぎてコンフルエントの状態を招く可能性があります。
また、コンフルエントを回避するために予め細胞数を少なく播種した場合にも、老化誘導処理した老化細胞はプレートアッセイに必要な感度（細胞数）が得られない可能性があります。

Q

96 wellプレートに播種する細胞数の目安はどれくらいですか？

A

至適細胞数は細胞種によって異なります。
弊社では、1×10⁴ cellsの WI-38細胞を各 wellに播種し、実験した実績がございます。

詳しい操作については、取扱説明書内の「実験例2」をご参照ください。
 

TTD-14-crown-4

11 イオン電極用試薬

TTD-14-crown-4

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  T302　 TTD-14-crown-4
• CAS番号
  151460-00-3
• 化学名
  2,2,3,3-Tetramethyl-9-tetradecyl-1,4,8,11-tetraoxacyclotetradecane
• 分子式・分子量
  C₂₈H₅₆O₄=456.74

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

–Cellstain^®– Hoechst 33342 solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– Hoechst 33342 solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

核染色用色素

• 製品コード
  H342　 –Cellstain^®– Hoechst 33342 solution
• CAS番号
  23491-52-3(Hoechst 33342:free base)
• 化学名
  2′-(4-Ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5′-bi-1H-benzimidazole, trihydrochloride, solution
• 分子式・分子量
  C₂₇H₃₁Cl₃N₆O=561.93

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

Hoechst 33258 ,Hoechst 33342 solutionの波長とこの２つの違いについて教えて下さい。

A

波長は以下の通りです。
Hoechst33342 Ex:350 nm Em:461 nm
Hoechst33258 Ex:352 nm Em:461 nm

基本的な使用方法は両方とも同じです。
弊社の製品は水溶液になっておりますので、
ご希望の濃度の希釈し、添加して下さい。

この二つの違いですが、基本的にはAdenine-Thymidine部に特異的に結合する薬品です。
生細胞の膜も通過し、生細胞のDNAとも結合します。
膜の透過率はHoechst 33342の方が若干上です。
Hoechst33258はdsDNA selectiveのようです。

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。

【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度がEBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488nm励起で観察されることもあります

Q

Hoechst33342の使用方法を教えてください。

A

一例として下記に示します。
・フローサイトメトリーによる培養株化細胞あるいは固形腫瘍の例
 

【試薬】

Hoechst33324 solution (1 mg/mL, 1.78 mmol/L)

【操作】

1)培養株化細胞あるいは固形腫瘍を0.25％トリプシンにて分離、浮遊細胞を用意する。

2)培養液で10 μmol/L Hoechst33342溶液とする。

3)細胞浮遊液10⁵個あたり、10 μmol/L Hoechst33342溶液を1 mL加える。

4)37℃,60分インキュベートする。

5)この染色液をフローサイトメトリーで測定する。

励起波長：352 nm、蛍光波長：461 nm

Glucose Uptake Assay Kit-Blue

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Glucose Uptake Assay Kit-Blue

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞老化
• 細胞内代謝
• 蛍光色素
• 顕微鏡
• FCM

グルコース取り込み検出キットBlue

• グルコース取り込み能力を高感度かつ簡便に測定できる
• 蛍光顕微鏡やフローサイトメーターで測定が可能
• 取り込まれた色素の漏れ出しを抑制し、再現性の高いデータを取得できる

• 製品コード
  UP01　 Glucose Uptake Assay Kit-Blue

使用回数の目安
1 set あたり、35 mm dish 12 枚、96-well microplate 1 枚

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

Glucose Uptake Probe-Blueはどのグルコーストランスポーターを介して取り込まれるのでしょうか？

A

複数のトランスポーターを介して細胞内へ取り込まれていると推測されますが、各グルコーストランスポーターに対する特異性や親和性に関する詳細なデータはございません。

Q

Glucose Uptake Probe-Blueは細胞内に取り込まれた後、分解・代謝されるのでしょうか？

A

蛍光色素部位は安定な構造を有しているため、実験操作内において分解されることはございません。グルコース部位は、構造上ヘキソキナーゼによるリン酸化を受けることが考えられますが、それ以降の代謝は行われないと考えられます。

Q

Glucose Uptake Probe-Blueを生細胞へ取り込ませた後、固定することは可能でしょうか？

A

プローブが細胞内から漏出するため、染色後の細胞を固定することはできません。

Q

Probe solutionは保存可能でしょうか？

A

Probe solutionは保存できません。Probe stock solutionは一か月間冷凍保存が可能です。

Q

バックグラウンドが高い場合、どうすればいいですか？

A

細胞に取り込まれなかったプローブが残存している可能性があります。再度WI solutionによる洗浄操作を一度行ってください。

Q

蛍光シグナルの変化が観察されない場合、どうすればいいですか？

A

初期検討としてプローブ濃度(x250～x1,000)や染色時間(15分～1時間程度)をご検討下さい。

Q

WI solutionを用いて洗浄した後、プローブはどのくらいの時間細胞内に保持されますか？

A

室温で約１時間程度は細胞内に保持されます。ただし、細胞の種類によって異なることが考えられます。

Q

グルコースの定量はできますか？

A

本製品を用いてグルコースを定量することはできません。

培地中のグルコース消費量や細胞内のグルコース量を定量したい場合は、弊社 グルコース代謝測定キット Glucose Assay Kit-WST (G264) をご使用下さい。

Q

取り込まれた色素の定量はできますか？

A

取り込まれた色素の定量を行う事はできません。本色素は、グルコース取り込み能力の増減を確認するための色素となります。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

TD19C6

11 イオン電極用試薬

TD19C6

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―イオノフォア

• 製品コード
  T402　 TD19C6
• CAS番号
  259874-18-5
• 化学名
  2,6,13,16,23,26-Hexaoxaheptacyclo[25.4.4.4^7,12.4^17,22.0^1,17.0^7,12.0^17,22]tritetracontane
• 分子式・分子量
  C₃₇H₆₂O₆=602.88

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

–Cellstain^®– PI

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– PI

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

死細胞染色色素

• 製品コード
  P346　 –Cellstain^®– PI
• CAS番号
  25535-16-4
• 化学名
  3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide
• 分子式・分子量
  C₂₇H₃₄I₂N₄=668.39

【注意】
–Cellstain^®– PIは、通常、チューブ底面にフィルム状に付着した状態となっております。
稀に、輸送中の振動等により本品がチューブ底面から外れ、チューブ壁面やキャップ裏に付着している場合がございます。
内容物を下に落としてから開封をしてご使用ください。
ご不明な点がございましたら、小社カスタマーリレーション部までお問合せください。（Free Dial：0120-489-548）

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。

【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

PIの使用方法を教えてください。

A

下記に例を示します。細胞の種類、観察条件により細胞の固定や試薬濃度を検討してください。

【使用例①】

Vollenweiderらはリンフォカイン活性化キラー(LAK)細胞の増殖アッセイにおいて、PI染色を行い、蛍光プレートリーダーを用いて測定している。
その時の濃度はストック溶液で 0.5 mg/mL PBS(-) 。使用濃度は 5 μg/mL クエン酸ナトリウム溶液を用い、1well当たり100 μL使用して蛍光染色している。
・I.Vollenweider, P.Groscurth, J.Immunol.Methods, 149, 133(1992).

【使用例②】

(1) 固形腫瘍あるいはcluster を含むサンプルについては、0.02% tripsin EDTAにて処理。

     37℃にて30分間インキュベート後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(2) -20℃の50% メタノールにて固定後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(3) -20℃の30% メタノールにて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(4) 0.2 mol/L phosphate buffer(pH7.2)にて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(5) RNaseの0.2 mol/L phosphate buffer(pH7.2)溶液(1mg/mL)を細胞106個あたり

     0.2 mL加え、37℃にて30分間インキュベートする。

(6) 0.2 mol/L phosphate にて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(7) PI溶液(50 μg/mL)を10mL加え、4℃にて2時間、遮光の上染色を行う。

・”フローサイトメトリー入門”より、医学書院発行

Q

EBやPIを使用した際の廃棄物があります。処理はどのようにすればよいですか？

A

＊施設によりガイドラインが定められている場合があります。ガイドラインがある場合にはそれに従って下さい。

廃液は排水処理設備がある場合には、排水として流してください。処理設備がない場合、排水は貯めておいて処理業者に依頼してください。

染色したゲルなどは乾燥して、焼却処分してください。

蛍光性物質を分解する場合には下記のような方法もあります。
・UV照射や日光にさらし分解する。
・次亜塩素酸ナトリウムにより酸化分解後、中和処理する。

Glucose Uptake Assay Kit-Green

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Glucose Uptake Assay Kit-Green

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞老化
• 細胞内代謝
• 蛍光色素
• 顕微鏡
• FCM

グルコース取り込み検出キットGreen

• グルコース取り込み能力を高感度かつ簡便に測定できる
• プレートリーダーを用いて測定が可能
• 取り込まれた色素の漏れ出しを抑制し、再現性の高いデータを取得できる

• 製品コード
  UP02　 Glucose Uptake Assay Kit-Green

使用回数の目安
1 set あたり、35 mm dish 12 枚、96-well plate 1 枚

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

Glucose Uptake Probe-Greenはどのグルコーストランスポーターを介して取り込まれるのでしょうか？

A

複数のトランスポーターを介して細胞内へ取り込まれていると推測されますが、各グルコーストランスポーターに対する特異性や親和性に関する詳細なデータはございません。

Q

使用実績のある細胞種を教えてください。

A

下記の細胞においてプローブの使用実績があります。

細胞		Probe stock solutinの希釈倍率	染色時間
ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞	A549	x 500	15分
ヒト肝癌由来細胞	HepG2	x 500	15分
前駆脂肪細胞	preadipocyte(3T3-L1)	x 500	15分
脂肪細胞	adipocyte(3T3-L1)	x 500	15分
悪性黒色腫	MO5	x 500	15分
マウス筋芽細胞	C2C12	x 500	5分
アストロサイト―マ	U-251 MG	x 500	15分
ヒト子宮頸癌由来細胞	HeLa	x 500	15分
ルイス肺がん由来細胞	3LL	x 50000	15分
T細胞	CD4+ T cell	x 50, x500	15分
マウスマクロファージ様株化細胞	J774.1	x 500	15分
線虫	N2	x 500	90分

Q

Glucose Uptake Probe-Greenは細胞内に取り込まれた後、分解・代謝されるのでしょうか？

A

蛍光色素部位は安定な構造を有しているため、実験操作内において分解されることはございません。グルコース部位は、構造上ヘキソキナーゼによるリン酸化を受けることが考えられますが、それ以降の代謝は行われないと考えられます。

Q

Glucose Uptake Probe-Greenを生細胞へ取り込ませた後、固定することは可能でしょうか？

A

プローブが細胞内から漏出するため、染色後の細胞を固定することはできません。

Q

プレートリーダーで測定する場合、どのプレートを使用すればよいでしょうか？

A

蛍光検出のため細胞培養用のブラックマイクロプレートをご使用ください。

Q

Probe working solutionは保存可能でしょうか？

A

Probe working solutionは保存できません。Probe stock solutionは冷凍保存が一か月間可能です。

Q

蛍光シグナルの変化が観察されない場合、どうすればいいですか？

A

初期検討としてプローブ濃度(x250～x1,000)や染色時間(15分～1時間程度)をご検討下さい。

Q

バックグラウンドが高い場合、どうすればいいですか？

A

細胞に取り込まれなかったプローブが残存している可能性があります。WI solutionによる洗浄操作をもう一度行ってください。

Q

Glucose Uptake Probe-Greenに細胞毒性はありますか？

A

弊社製品のCell Counting Kit-8 (CK04)を用いてA549細胞におけるプローブの細胞毒性を調査した結果、細胞毒性は確認されませんでした。

Q

WI solutionを用いて洗浄した後、プローブはどのくらいの時間細胞内に保持されますか？

A

室温で約１時間程度は細胞内に保持されます。ただし、細胞の種類によって異なることが考えられます。

Q

グルコースの定量はできますか？

A

本製品を用いてグルコースを定量することはできません。

培地中のグルコース消費量や細胞内のグルコース量を定量したい場合は、弊社 グルコース代謝測定キット Glucose Assay Kit-WST (G264) をご使用下さい。

Q

取り込まれた色素の定量はできますか？

A

取り込まれた色素の定量を行う事はできません。本色素は、グルコース取り込み能力の増減を確認するための色素となります。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

–Cellstain^®– PI solution

03 分子生物学関連試薬

05 細胞染色用色素

–Cellstain^®– PI solution

• 分子生物学関連試薬
• 細胞染色用色素

死細胞染色色素

• 製品コード
  P378　 –Cellstain^®– PI solution
• CAS番号
  25535-16-4(PI)
• 化学名
  3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide, solution
• 分子式・分子量
  C₂₇H₃₄I₂N₄=668.39

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

核染色剤に使用される色素の特徴、違いは何でしょうか？

A

ここで紹介している色素は核酸との相互作用により蛍光を発するか、蛍光強度が強くなる特徴があります。
蛍光波長以外の違いとしては下記の点がございます。

【EB】
塩基特異性は無く、全DNA,RNAに結合します。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【PI】
EBと同様に塩基特異性はありません。インターカレーションした時の蛍光強度が
EBより高いため、より広く使用される色素です。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【DAPI】
２重鎖の副溝(minor groove)と結合します。アデニン-チミジンクラスターに高い結合性を持っています。
生細胞の膜透過性がなく、死細胞を染色します。

【AO】
２重鎖にインターカレーションしたときと、単鎖のリン酸に結合した時では蛍光波長が異なることを
利用して、２重鎖と単鎖を区別して検出できます。
生細胞の細胞膜を透過します。

【Hoechst33342､33258】
DNAのアデニン-チミジン部に特異的に結合します。
生細胞の細胞膜を透過し、生細胞のDNAを染色できる色素です。

Q

細胞染色色素の励起と蛍光の波長を教えて下さい。

A

＊AOはフローサイトメトリーなどでは488 nm励起で観察されることもあります

Q

固定化後に染色すると、核が染まらないのですが何か対策はありますか？

A

固定化および膜透過処理の条件によっては核が染まらないことがあります。
その際は、処理条件をご検討頂く必要があります。

なお、PFA（パラホルムアルデヒド）固定化処理を長時間することで、核が染まらない事例がございます。
下記、弊社での事例を参考に固定化および膜透過処理の条件をご検討ください。

○PIで核を染色できた処理条件
使用細胞 ： HeLa細胞
固定化処理：4% PFA/PBSにて5分間インキュベート
膜透過処理：1% Triton X-100/PBSにて20分間インキュベート

上記処理後に、PI solution 30 μg/mLにて染色して観察

○PI染色後、核が染まらない結果となった条件
使用細胞 ： HeLa細胞
固定化処理：2% PFA/PBSにて60分間インキュベート
膜透過処理：1% NP-40/PBSにて60分間インキュベート

上記処理後に、PI solution 30 μg/mLにて染色して観察

Q

PIの使用方法を教えてください。

A

下記に例を示します。細胞の種類、観察条件により細胞の固定や試薬濃度を検討してください。

【使用例①】

Vollenweiderらはリンフォカイン活性化キラー(LAK)細胞の増殖アッセイにおいて、PI染色を行い、蛍光プレートリーダーを用いて測定している。
その時の濃度はストック溶液で 0.5 mg/mL PBS(-) 。使用濃度は 5 μg/mL クエン酸ナトリウム溶液を用い、1well当たり100μL使用して蛍光染色している。
・I.Vollenweider, P.Groscurth, J.Immunol.Methods, 149, 133(1992).

【使用例②】

(1) 固形腫瘍あるいはcluster を含むサンプルについては、0.02% tripsin EDTAにて処理。

     37℃にて30分間インキュベート後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(2) -20℃の50% メタノールにて固定後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(3) -20℃の30% メタノールにて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(4) 0.2 mol/L phosphate buffer(pH7.2)にて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(5) RNaseの0.2 mol/L phosphate buffer(pH7.2)溶液(1 mg/mL)を細胞106個あたり

     0.2 mL加え、37℃にて30分間インキュベートする。

(6) 0.2 mol/L phosphate にて洗浄後、1500rpmで5分間行い、上清を捨てる。

(7) PI溶液(50 μg/mL)を10mL加え、4℃にて2時間、遮光の上染色を行う。

・”フローサイトメトリー入門”より、医学書院発行

Q

EBやPIを使用した際の廃棄物があります。処理はどのようにすればよいですか？

A

＊施設によりガイドラインが定められている場合があります。ガイドラインがある場合にはそれに従って下さい。

廃液は排水処理設備がある場合には、排水として流してください。下記方法により分解して、廃水処理すればより安全です。

・UV照射や日光にさらし分解する。
・次亜塩素酸ナトリウム等により酸化分解する。

処理設備がない場合、分解し、廃水を貯めておいて処理業者に依頼してください。

染色したゲルなどは乾燥して、焼却処分してください。

TFPB

11 イオン電極用試薬

TFPB

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―アニオン排除剤

• 製品コード
  T037　 TFPB
• CAS番号
  79060-88-1
• 化学名
  Tetrakis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]borate, sodium salt
• 分子式・分子量
  C₃₂H₁₂BF₂₄Na=886.2

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Agarose-I

• 分子生物学関連試薬

分子生物学関連試薬-Agarose

• 製品コード
  A003　 Agarose-I
• CAS番号
  9012-36-6
• 化学名
  Agarose

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

DOPP

11 イオン電極用試薬

DOPP

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―液膜型イオン電極用溶媒

• 製品コード
  D016　 DOPP
• CAS番号
  1754-47-8
• 化学名
  Di-n-octyl phenylphosphonate
• 分子式・分子量
  C₂₂H₃₉O₃P=382.52

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Glucose Uptake Assay Kit-Red

01 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬

Glucose Uptake Assay Kit-Red

• 細胞増殖/細胞毒性測定用試薬
• 細胞機能解析
• 細胞老化
• 細胞内代謝
• 蛍光色素
• 顕微鏡
• FCM

グルコース取り込み検出キットRed

• グルコース取り込み能力を高感度かつ簡便に測定できる
• プレートリーダーやフローサイトメーターでも測定が可能
• 取り込まれた色素の漏れ出しを抑制し、再現性の高いデータを取得できる

• 製品コード
  UP03　 Glucose Uptake Assay Kit-Red

使用回数の目安
1 set あたり、35 mm dish 12 枚、96-well microplate 1 枚

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Q

Glucose Uptake Probe-Redはどのグルコーストランスポーターを介して取り込まれるのでしょうか？

A

複数のトランスポーターを介して細胞内へ取り込まれていると推測されますが、各グルコーストランスポーターに対する特異性や親和性に関する詳細なデータはございません。

Q

Glucose Uptake Probe-Redは細胞内に取り込まれた後、分解・代謝されるのでしょうか？

A

蛍光色素部位は安定な構造を有しているため、実験操作内において分解されることはございません。グルコース部位は、構造上ヘキソキナーゼによるリン酸化を受けることが考えられますが、それ以降の代謝は行われないと考えられます。

Q

Glucose Uptake Probe-Redを生細胞へ取り込ませた後、固定することは可能でしょうか？

A

プローブが細胞内から漏出するため、染色後の細胞を固定することはできません。

Q

プレートリーダーで測定する場合、どのプレートを使用すればよいでしょうか？

A

蛍光検出のため細胞培養用のブラックマイクロプレートをご使用ください。

Q

Probe working solutionは保存可能でしょうか？

A

Probe solutionは保存できません。Probe stock solutionは一か月間冷凍保存が可能です。

Q

蛍光シグナルの変化が観察されない場合、どうすればいいですか？

A

初期検討としてプローブ濃度(x250～x1,000)や染色時間(15分～1時間程度)をご検討下さい。

Q

バックグラウンドが高い場合、どうすればいいですか？

A

細胞に取り込まれなかったプローブが残存している可能性があります。再度WI solutionによる洗浄操作を行ってください。

Q

WI solutionを用いて洗浄した後、プローブはどのくらいの時間細胞内に保持されますか？

A

室温で約１時間程度は細胞内に保持されます。ただし、細胞の種類によって異なることが考えられます。

Q

グルコースの定量はできますか？

A

本製品を用いてグルコースを定量することはできません。

培地中のグルコース消費量や細胞内のグルコース量を定量したい場合は、弊社 グルコース代謝測定キット Glucose Assay Kit-WST (G264) をご使用下さい。

Q

取り込まれた色素の定量はできますか？

A

取り込まれた色素の定量を行う事はできません。本色素は、グルコース取り込み能力の増減を確認するための色素となります。

この製品に関連する研究では、下記の関連製品も使われています。

NPOE

11 イオン電極用試薬

NPOE

• イオン電極用試薬

イオン電極用試薬―液膜型イオン電極用溶媒

• 製品コード
  N015　 NPOE
• CAS番号
  37682-29-4
• 化学名
  2-Nitrophenyl octyl ether
• 分子式・分子量
  C₁₄H₂₁NO₃=251.32

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル

Agarose 900

• 分子生物学関連試薬

分子生物学関連試薬-Agarose

• 製品コード
  A426　 Agarose 900
• CAS番号
  9012-36-6
• 化学名
  Agarose

• ご購入方法
• お問い合わせ

マニュアル