DNA 的提取

酚－氯仿提取法

取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。

将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。

将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。

取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。

上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。

将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。

勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中。

加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。

取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。

取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。

轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。

依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。

测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。

样品在4℃下保存备用。

附: 提DNA 所用试剂配方：

1. 1M Tris.Cl

1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至8.5后定溶至1升， 灭菌。

2. 0.5M EDTA pH8

1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调 pH至8.0，定溶至 1 升。

3. 20% SDS

2L: 在2L热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存。

4. 5M NaCl

1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 灭菌。

5. 缓冲液“S” 配1L缓冲液“S”

100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml

100mM NaCl 5M NaCl 20ml

50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml

2% SDS 20% SDS 100ml

H2O 680ml

6. 100x TE

1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调 pH至8.0, 定溶， 灭菌。

7. 50x TAE

1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶。

8. 蛋白酶K溶液的配制

用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K溶液； 或用超纯水配制成相同的浓度。

9. RNase (去DNA酶的RNA酶）

用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20℃下 保存。

10. 3M NaAc pH5.2

1L: 600ml H2O中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH至5.2， 然 后定溶1L ，灭菌，