DNA片段的连接技术

实验十三 DNA片段的连接技术
一、目的与原理
DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的5‘磷酸和3’羟基间可有连接酶催化形成磷酸二酯键,这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)DNA连接酶和T4DNA连接酶催化,但是分子生物学试验中主要采用T4DNA连接酶,因该酶在正常条件下,即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片断的连接操作,掌握这一DNA片段的连接技术。
二、材料和方法
1. 仪器
离心机,恒温设备,真空干燥机,取液器
2. 试剂
T4DNA连接酶,10×T4DNA连接酶缓冲液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500μg/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、λDNA、酚,TE缓冲液,电泳缓冲液、3M NaAc
三、操作步骤
取干净、灭菌新Eppendorf管,按下表加入各试液
试液 体积(μl)
T4DNA连接酶缓冲液 1.5
λDNA 10
ATP 1
无菌水 1.5
连接酶 1
总体积 15
19–20℃ 保温2小时,提取已连接好的DNA片段。电泳分析。
四、结果 (略)
五、注意事项
1、 该实验用的T4DNA连接酶最适反应是37℃,但该温度下DNA退火效率低,连接效率还不如22℃高。
2、 如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效,可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功,则说明有效。
实验十四 受体菌感受态细胞的制备
一、目的与原理
当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时,即为感受态,而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一个重要的技术环节。本试验是通过钙离子来诱导使之成为感受态细胞。
二、材料和方法
1. 材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2. 仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3. 试剂
LB培养基,0.1M MgCl2,3mM氯化六氮合高钴
TFB:10Mm MES(pH6.3)
45Mm MnCl2
10Mm CaCl2
10Mm KCl
三、操作步骤
大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)在LB培养基平板上划线培养12-16小时,挑取单菌落于LB培养基摇瓶培养大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)到对数期。取1ml培养物7000rpm,离心3min,收集菌体。再重复一次。冰浴放置。用预冷的氯化镁悬浮菌体7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。用预冷的氯化钙悬浮菌体,冰浴15min, 7000rpm离心3min。收集菌体,冰浴放置。加入200μl预冷的氯化钙(或TFB),放置于冰浴,即得感受态细胞,此细胞可现用,也可进行下步操作。将悬液分装于无菌离心管中,投入液氮,然后储于-70℃保存。
四、结果 (略)
五、注意事项
一般地,新制备的感受态细胞48h后转化效率降低,15d后失效。因此,感受态细胞不能保存太久,4℃保存一周,但-80℃可保存1年。用试管分装可避免反复冻熔,损伤感受态细胞。
实验十五 重组片段的转化及克隆和筛选
一、目的与原理
转化是指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转化技术在基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)领域中占有极重要的地位。目前用得较多的转化技术为将人工构建的重组质粒到如受体细胞,使重组质粒在受体细胞中稳定地复制和表达。
二、材料和方法
1.材料:大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)
2.仪器:
离心机,恒温摇床,恒温水浴,超净工作台,冰柜
3.试剂
LB培养基; 0.1M mM CaCl2 ; 0.1M MgCl2 ;
TFB:10mM MES(pH 6.3),45mM MnCl2, 10mM CaCl2, 100mM KCl
三、操作步骤
1. 感受态细胞融化(在手心)
2. 加入溶于TE的待转化外源DNA,冰浴30min。
3. 42℃热冲击2 min。
4. 冰上2min。
5. 加入0.4 ml LB液体培养基,37℃保温摇床45 min
6. 取0.2ml菌悬液涂布在含氨苄青霉素、IPTG、X-gal培养基上,37℃培养。
四、实验结果及分析:
培养皿上有白色菌落和兰 色菌落,但兰色菌落数量很少。由于受体细胞本身的菌落为兰色,所以白色菌落说明转化成功;兰色应为转化不成功。但是由于转化的质粒经过了酶切和连接,若是在原酶切位点的连接进行的转化,菌落为白色;若为酶切去一段DNA的的连接质粒进行的转化,菌落为兰色(说明在酶切上成功,连接上也成功,转化上也成功)。
五、注意事项
关键要严格控制热激时间,超过2min,则转化会失败。
免疫学实验
实验十六 单向琼脂扩散实验
一、原理
单向琼脂扩散实验又称单向免疫扩散实验。指可溶性抗原在相应抗体的琼脂介质中的扩散,可定性、定量抗原。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.取15ml琼脂糖加到56℃预热玻璃管中,加入约200微升抗血清,充分混匀后铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.待凝胶凝固后打孔,直径为3㎜,将孔内琼脂弄出。
4.将系列稀释的标准抗原和待检抗原分别加到凝胶孔内,每孔5微升。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果。
三、实验结果
发现沉淀环的大小与抗原的浓度成反比,基本成线性相关。其大小不仅与孔中抗原的浓度相关,而且和琼脂中抗体的浓度有关。
实验十七 双向琼脂扩散实验
一、原理
双向琼脂扩散实验,是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散,当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时,就会形成抗原抗体复合物的沉淀。
二、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。
3.打孔,孔距为4㎜,
4.将抗血清按二倍稀释法稀释成1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32的不同浓度。
在周围孔中加入不同浓度的抗体,中心孔加抗原。
将凝胶板置于湿盒内,室温过夜,观察结果
三、实验结果
浓度不同,形成不同的沉淀的线。
实验十八 免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台,将1%琼脂糖融化,56℃水浴中保温。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.在孔内加入抗原,其中一孔内加电泳指示剂。
4.将凝胶板放在电泳槽中进行电泳,确定电泳时间。
5.电泳后在凝胶板上沿电泳方向平行挖2㎜宽的长槽,加入抗血清。
二、实验结果
将凝胶板放入湿盒,室温放置12小时,可观察在到沉淀弧线。
实验十九 对流免疫电泳
一、操作步骤
1.1%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,凉干。
3.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
4.在孔内分别加入抗原和抗体,每孔5微升,抗体点阳极,抗原点阴极。
5.在电场中电泳50min,5V。
二、实验结果
在小孔中间出现沉淀线。
实验二十 火箭免疫电泳
一、操作步骤
1.取一块干净的玻璃板,用少量75%乙醇冲洗,晾干后置于水平台。
3%琼脂糖融化后,置于56℃备用。
2.将琼脂糖铺于玻璃板上,厚度约为1㎜。凝固后,打孔。
3.将抗原按倍比稀释,在孔内分别加入标准抗原和代测样品,每孔5微升。
在10V电场中电泳3小时。
二、实验结果
发现在电泳方向上有拖尾,拖尾长度与抗原浓度有关。

 

新烟碱类农残混合标准溶液(每个20μg/mL溶于乙腈溶剂中)


产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 产品价格
145-09463 Neonicotinoid Pesticide Mixture Standard Solution(each 20μg/mL Acetonitrile Solution)
新烟碱类农残混合标准溶液(每个20μg/ml溶于乙腈溶剂中)
1mL×5A

新烟碱系农药混合标准液


  新烟碱类农药广泛使用于稻子、果树、蔬菜、花等中,被怀疑是近年来世界蜜蜂减少问题的原因之一,已有国家开始限制使用。

  和光有新烟碱类农药及其代谢物的混合标准液、前处理柱、HPLC分析柱,可以用于农药的同时分析。

◆新烟碱类农药混合标准液(各20μg/mL乙腈溶液)

10成分混合标准液的分析例

新烟碱类农残混合标准溶液(每个20μg/mL溶于乙腈溶剂中)


表1 混合成分

Peak No.

成分名

离子检测(m/z)

Mode

1

CPMF

212

2

Dinotefuran

203

3

Nitenpyram

271

4

Thiamethoxam

292

5

Clothianidin

250

6

Imidacloprid

256

7

Thiacloprid-amide

271

8

CPF

199

9

Acetamiprid

223

10

Thiacloprid

253


新烟碱类农残混合标准溶液(每个20μg/mL溶于乙腈溶剂中)

【装置】

LC/MS-2020(岛津)

【LC】

分析柱 : Wakopak® Ultra C18-3, 2.0mm×100mm

洗脱液:A) 0.1 vol%甲酸-5mM醋酸铵溶液

        B) 甲醇

梯度 : 0-10min. B conc.10%

       10-30min. B conc.10-70%

流 速 : 0.2mL/min. at 30℃

注入量 : 0.5μL

【MS】

离子法:ESI、positive mode



固相萃取柱采集例

  新烟碱类农药混合标准液的混合成分10成分加上代谢物6-氯烟酸 、以及由于结构式相似而检测的相关农药氟啶虫酰胺共12成分,讨论这12成分的回收率。固相萃取条件图1,回收率结果图2显示。 

  在250mL水中添加标准品,使用反相系聚合物树脂的充填固相萃取柱Presep® RPP(填充量500㎎),能高效率回收6-氯烟酸以外的农药及代谢物。

  代谢物CPMF的洗脱需要增加溶剂量实现回收。

  同时,使用反相模式和离子交换模式共有的Presep® RPP-离子交换柱4种,能使农药和特定代谢物分离洗脱。


1 固相萃取条件

新烟碱类农残混合标准溶液(每个20μg/mL溶于乙腈溶剂中)


表2 250mL水样的回収率(各添加0.2ng/mL)

农药名称

回收率(%)
馏分1

回收率(%)
馏分2

Acetamiprid

106

ND

Imidacloprid

110

ND

Thiacloprid

99

ND

Nitenpyram

103

ND

Clothianidin

102

ND

Thiamethoxam

96

ND

Dinotefuran

98

ND

Flonicamid

105

ND

 

代谢物

 

CPF

104

ND

CPMF

3

64

6-Chloronicotinic Acid

ND

ND

Thiacloprid-amide

95

ND

◆产品


产品编号

产品名称

级别

规格

145-09463

Neonicotinoid Pesticide Mixture Standard Solution
     (each 20μg/mL Acetonitrile Solution)

残留农药试验

1mL×5A

相关产品


混合农药成分 单一标准品

产品编号

产品名称

级别

规格

034-19271

CPMF Standard

残留农药试验

200mg

041-29731

Dinotefuran Standard

残留农药试验

100mg

142-06771

Nitenpyram Standard

残留农药试验

200mg

201-19061

Thiamethoxam Reference Material

TraceSure®

100mg

034-22581

Clothianidin Reference Material

TraceSure®

100mg

099-03771

Imidacloprid Standard

残留农药试验

200mg

204-15771

Thiacloprid-amide Standard

残留农药试验

 50mg

037-17201

CPF Standard

残留农药试验

200mg

010-24541

Acetamiprid Reference Material

TRM

100mg

205-19081

Thiacloprid Reference Material

TraceSure®

100mg

 

新烟碱系农药代谢物、相关农药(混合成分以外)

产品编号

产品名称

级别

规格

039-23491

6-Chloronicotinic Acid Standard

残留农药试验

100mg

031-19421

CPMA Standard

残留农药试验

100mg

060-04881

Flonicamid Standard

残留农药试验

200mg

055-07571

Ethiprole Standard

残留农药试验

200mg

069-05951

Fipronil Reference Material

TRM

100mg

 

分析柱 :  Wakopak® Ultra系列

产品编号

产品名称

应用

尺寸

型号

232-63581

Wakopak® Ultra C18-3(粒子径3μm)

HPLC

2.0mm×100mm

D

238-63583

W

239-63513

Wakopak® Ultra C18-2(粒子径2μm)

UHPLC

2.1mm×100mm

W

Wakopak® Ultra是能使用的pH范围广、碱性条件下能使用且具有高耐久性的ODS柱。另有尺寸不同粒子径5μm的分析柱。详细请咨询。


固相萃取柱 :  Presep® 系列

产品编号

产品名称

应用

填充量

规格

290-37051

Presep® RPP

试料前处理

500mg/6mL

10 ea× 5

294-36851

Presep® RPP

试料前处理

 60mg/3mL

10 ea× 5

297-33301

Presep® RPP-SAX

试料前处理

 60mg/3mL

10 ea×10

291-34921

Presep® RPP-SCX

试料前处理

 60mg/3mL

10 ea×10

291-33941

Presep® RPP-WAX

试料前处理

 60mg/3mL

10 ea×10

292-34831

Presep® RPP-WCX

试料前处理

 60mg/3mL

10 ea×10

各种填充剂、填充量的萃取柱产品丰富。

鹿genius®病原基因检测PCR配套元件(腹泻原性大肠菌用)|基因检测试剂|生化学试剂-基因工程|试剂|关东化学株式会社

鹿genius®病原基因检测PCR配套元件(腹泻原性大肠菌用)|基因检测试剂|生化学试剂-基因工程|试剂|关东化学株式会社腹泻原性大肠菌(Diarheageniccoli E .),人类腹痛、腹泻症引起大肠杆菌的总称,性质和症状的不同,7种被分类。本试剂盒,多路PCR遗传基因放大,其扩增产物进行确认,在日本主要被报告的5种的致病基因的保有状况确认。

特长

三种混合用底漆,肠管病原性大肠菌(EPEC),肠管出血性大肠菌(EHEC),肠道毒素性大肠菌(ETEC),肠管侵入性大肠菌(EIEC),肠管凝集性大肠菌(EAEC)的病原性有关的遗传基因可检测

检测结果数值化,从而容易判定可能

配套元件的构成

个别名称 容量 数量
试剂A AptaTaq DNA主人(5×Conc .)* 1.2毫升 一本书
试剂B PCR附录 1.1毫升 一本书
试剂C 引物混合1 0.4毫升 一本书
试剂D 引物混合2 0.4毫升 一本书
试剂E 引物混合3 0.4毫升 一本书
试剂F 积极控制 0.4毫升 一本书
试剂G 6×装入缓冲区(BPB·XC) 1.2毫升 一本书
* AptaTaq DNA主人(5×Conc设置Roche Diagnostics K . K .的商品。

操作步骤

增菌、分离培养 大肠菌分离的
DNA抽出 鹿genius®DNA抽出试剂使用DNA模板调制
PCR 3种多路PCR进行
电泳 3%琼脂糖凝胶电泳进行
检测 溴化乙锭溶液检测PCR检测,片段
判定 专用的计算表结果输入,病原型的进行判断

解析

鹿genius®病原基因检测PCR配套元件(腹泻原性大肠菌用)|基因检测试剂|生化学试剂-基因工程|试剂|关东化学株式会社

电泳模式

100 : 100个基点DNA梯形P:积极的控制1:ATCC®35150(EHEC)2:ATCC®43887(EPEC)3:ATCC®35401(ETEC)4:ATCC®43893(EIEC)5:ATCC®25922(非病原性大肠菌)6~10:临床分离股票 泳动条件,3%琼脂糖KANTO A的酒馆熊猫聚会(1×TBE缓冲液),Mupid – exU运用,100伏35分钟。13孔的梳子,用样品8μL电器了泳动了。 *使用了琼脂糖凝胶,一张凝胶13孔梳子3个刺制作着。

样品号码
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
系数的合计值 97 1 24 4 0 97 1 24 16 2
病原型的判定 EHEC EPEC ETEC EIEC 其他 EHEC EPEC ETEC ETEC EAEC

检测基因和其PCR扩增产物尺寸

系数 放大尺寸(bp) 目标领域
Reactionmixture 1 1 速率 eaeA
32 132 stx 1
64 93 stx 2
Reactionmixture 2 16 130 est
8 62 elt
Reactionmixture 3 2 575 aggR
4 可以 invE
内标控制 120 rDNA 16 s

* <em>InvE</em>基因,质粒上有侵入性基因的缘故,脱落的情况。

①3个多路PCR的电泳结果从乐队读取模式。 ②这电泳乐队的有无的结果用,分析用EXCEL表二进法输入,病原型的判定进行。 ③16 s rDNA阳性的情况,大肠杆菌的估计。

合计点和腹泻原性大肠菌的病原型

合计点 病原型
0 EHEC / STEC,EPEC,ETEC,EIEC,EAEC以外的大肠菌或必须是近亲的微生物
1 EPEC
2 EAEC
4~7 EIEC
8~11 ETEC(+)<em>elt</em>
16~19 ETEC(+)<em>est</em>
24~27 ETEC(<em>est</em> +、<em>elt</em> +)
32~35 EHEC / STEC(+)<em>stx 1</em>
64~67 EHEC / STEC(+)<em>stx 2</em>
96~99 EHEC / STEC(<em>stx 1</em> +、<em>stx 2</em> +)
上述以外 混合被怀疑感染

* EIEC和痢疾杆菌区别不能。合计点36的情况,志賀痢疾杆菌的可能性被怀疑。stx(*2志賀毒素2基因型地产生),根据变体检测不能的情况。例)stx 2f

产品信息

产品名 包装 产品编号
鹿genius®致病基因检测试剂盒(PCR腹泻原性大肠菌用) 一包(100次) 08087 – 96
鹿genius®DNA抽出试剂 一包(120次) 08178 – 96

最新的价格是Cica – Web请参照。

其他厂家的商品相关的许可证、专利方面,各厂商请确认。

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POT套件·PCR套件

产品名 包装 产品编号
鹿genius®分子疫学分析POT套件(黄色葡萄球菌用) 一包(30回) 08180 – 96
一包(120次) 08180 – 97
鹿genius®分子疫学分析POT配套元件(绿脓菌用) 一包(30回) 08187 – 96
鹿genius®分子疫学分析POT配套元件(不动杆菌属菌用) 一包(30回) 08062 – 96
鹿genius®分子疫学分析POT配套元件(大肠菌用) 一包(30回) 08362 – 97
鹿genius®ESBL基因型检测试剂盒 一包(30回) 08112 – 96
鹿genius®カルバペネマーゼ基因型检测试剂盒 一包(30回) 08114 – 96
鹿genius®毒素基因检测试剂盒(C . difficile用) 一包(30回) 08115 – 96
鹿genius®コアグラーゼ检测套(黄色葡萄球菌用) 一包(50次) 08179 – 96

最新的价格是Cica – Web请参照。


分离培养基

产品名 包装 产品编号
黑藻アガーSTEC生培养基 10张 72090

最新的价格是Cica – Web请参照。


电泳相关

产品名 包装 产品编号
琼脂糖KANTO A的酒馆熊猫聚会了 100克 01089 – 23
10×TBE缓冲液 一L 46510 : 79
溴化乙锭溶液(2毫克/毫升瓶装),眼药水 10毫升 14575 : 43
Quick‐Load 100个基点DNA Ladder gel lanes 125 49881 – 04
TriDye 100个基点DNA Ladder gel lanes 125 49881 – 60
6倍浓缩装入缓冲器 2 mL×6本 24080 – 96

最新的价格是Cica – Web请参照。

参考文献

1)公立大学法人大阪市立大学,KALS株式会社,株式会社二共刃型工業;“腹泻原性大肠杆菌检测方法”,专利公开2008 – 283895 2)Ruttler,M . E .el atBiocell30(2): 301 – 308,2006 3)Hiroe,Aet alAppl,Environ,Microbiol78(9):3177 – 3184,2012

宣传手册、说明书(PDF)

小册子鹿genius®病原基因检测PCR配套元件(腹泻原性大肠菌用)(436 KB)

小册子基因检测相关产品指南(2.3 MB)

取扱说明书(390 KB)

计算表(ZIP文件,Excel)

分析用EXCEL表

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L-谷氨酸[谷氨酸盐/谷氨酸酯/味精/谷氨酸单钠]检测试剂盒

L-谷氨酸[谷氨酸盐/谷氨酸酯/味精/谷氨酸单钠]检测试剂盒

1) 英文:L-Glutamic Acid (L-Glutamate/MSG) Assay Kit;

2) 中文:L-谷氨酸[谷氨酸盐/谷氨酸酯/味精/谷氨酸单钠]检测试剂盒;

3) 规格: 60;

4) 货号:K-GLUT

商品说明:

The L-Glutamic Acid test kit is a simple, reliable, rapid and accurate method for the measurement and analysis of L-glutamate (MSG) in foodstuffs.
Suitable for manual, auto-analyser and microplate formats.

Colourimetric method for the determination of L-Glutamic Acid
(Monosodium Glutamate; MSG) in foodstuffs and other materials

Principle:
(beef liver glutamate dehydrogenase)
(1) L-Glutamic acid + NAD+ + H2O ↔ 2-oxoglutarate + NADH + NH4+

(diaphorase)
(2) INT + NADH + H+ → NAD+ + INT-formazan

Kit size: 60 assays (manual) / 600 (microplate)
/ 700 (auto-analyser)
Method: Spectrophotometric at 492 nm
Reaction time: ~ 9 min
Detection limit: 0.21 mg/L
Application examples:
Fruit and vegetables (e.g. tomato), processed fruit and vegetables
(e.g. tomato puree / juice, ketchup, soy sauce), condiments, processed
meat products (e.g. extracts, bouillon and sausages), soup, pharmaceuticals
and other materials (e.g. biological cultures, samples, etc.)
Method recognition:
Methods based on this principle have been accepted by ISO, GOST
and NMKL

Advantages

  • Very competitive price (cost per test)
  • All reagents stable for > 2 years after preparation
  • Glutamate dehydrogenase solution stable at -20°C
  • No wasted diaphorase solution (stable suspension supplied)
  • Rapid reaction
  • Mega-Calc™ software tool is available from our website for hassle-free raw data processing
  • Standard included
  • Suitable for manual, microplate and auto-analyser formats