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Fluorescein Labeling Kit – NH₂

08 ラベル化剤

Fluorescein Labeling Kit – NH₂

ラベル化剤
蛍光色素
顕微鏡
FCM
50-200㎍
NH₂

抗体・タンパク質標識キット

初めて蛍光標識をする
簡単な操作で実験したい
抗原認識部位を妨害しない低分子で標識したい

製品コード

LK01　 Fluorescein Labeling Kit – NH₂

容　量	メーカー希望小売価格	富士フイルム和光純薬
3 samples	￥23,600	347-90911

サンプル量	50-200 µg
所要時間	2時間
標識部位	-NH₂
検出方法	顕微鏡・FCM
蛍光特性	[Ex:500, Em:525]
・分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。・Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。・付属の保存溶液でフルオレセイン標識体の保存ができる。

キット内容

3 samples	・NH₂-Reactive Fluorescein ・WS Buffer ・Reaction Buffer ・Filtration Tube	3 tubes 4 ml x1 500 μl x1 3 tubes

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マニュアル

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Fluorescein Labeling Kit – NH₂の使い方

技術情報

特長

1) 約2時間でフルオレセイン標識体が調製できる。
2) 分子量50,000以上のタンパク質が標識できる。
3) 50～200 μgのタンパク質を標識可能である。
4) Filtration Tubeを用いた分離操作により高い回収率で標識体が得られる。
5) 付属の保存溶液でフルオレセイン標識体の保存ができる。

参考文献

参考文献を表示する

1) M. Hiyoshi, S. Suzu, Y. Yoshidomi, R. Hassan, H. Harada, N. Sakashita, H. Akari, K. Motoyoshi and S. Okada, "Interaction between Hck and HIV-1 Nef Negatively Regulates Cell Surface Expression of M-CSF Receptor", Blood, 2008, 111(1), 243.
2) W. Aung, A. Tsuji, H. Sudo, A. Sugyo, T. Furukawa, Y. Ukai, Y. Kurosawa and T. Saga, "Immunotargeting of Integrin α6β4 for Single-Photon Emission Computed Tomography and Near-Infrared Fluorescence Imaging in a Pancreatic Cancer Model", Molecular Imaging, 2016, 15, 1.
3) A. Shinya, K. Yamamoto, M. Kurata, S. Abe-Suzuki, R. Horii, F. Akiyama and M. Kitagawa, "Targeting MCM2 function as a novel strategy for the treatment of highly malignant breast tumors", Oncotarget., 2015, 6, (33), 34892.
4) K.M. Nishida, T.N. Okada, T. Kawamura, T. Mituyama, Y. Kawamura, S. Inagaki, H. Huang, D. Chen, T. Kodama, H. Siomi and M.C. Siomi, "Functional involvement of Tudor and dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines", EMBO J.., 2009, 28, (24), 3820.
5) P.G. Sreekumar, R. Kannan, M. Kitamura, C. Spee, E. Barron, S.J. Ryan and D.R. Hinton, "αB crystallin is apically secreted within exosomes by polarized human retinal pigment epithelium and provides neuroprotection to adjacent cells", PLoS ONE., 2010, 5, (10), e12578.
6) R. Asano, T. Kumagai, K. Nagai, S. Taki, I. Shimomura, K. Arai, H. Ogata, M. Okada, F. Hayasaka, H. Sanada, T. Nakanishi, T. Karvonen, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T. Kudo, M. Umetsu and I. Kumagai, "Domain order of a bispecific diabody dramatically enhances its antitumor activity beyond structural format conversion: the case of the hEx3 diabody", Protein Eng. Des. Sel.., 2013, 26, (5), 359.
7) R. Asano, I. Shimomura, S. Konno, A. Ito, Y. Masakari, R. Orimo, S. Taki, K. Arai, H. Ogata, M. Okada, S. Furumoto, M. Onitsuka, T. Omasa, H. Hayashi, Y. Katayose, M. Unno, T. Kudo, M. Umetsu and I. Kumagai, "Rearranging the domain order of a diabody-based IgG-like bispecific antibody enhances its antitumor activity and improves its degradation resistance and pharmacokinetics", MAbs., 2014, 6, (5), 1243.
8) R. Asano, K. Ikoma, I. Shimomura, S. Taki, T. Nakanishi, M. Umetsu and I. Kumagai, "Cytotoxic enhancement of a bispecific diabody by format conversion to tandem single-chain variable fragment (taFv): the case of the hEx3 diabody", J. Biol. Chem.., 2011, 286, (3), 1812.
9) T. Toyotome, M. Yamaguchi, A. Iwasaki, A. Watanabe, H. Taguchi, L. Qin, H. Watanabe and K. Kamei, "Fetuin A, a serum component, promotes growth and biofilm formation by Aspergillus fumigatus", Int. J. Med. Microbiol.., 2012, 302, (2), 108.
10) W. Ma, V. Schubert, M. M. Martis, G. Hause, Z. Liu, Y. Shen, U. Conrad, W. Shi, U. Scholz, S. Taudien, Z. Cheng and A. Houben, "The distribution of α-kleisin during meiosis in the holocentromeric plant Luzula elegans", Chromosome Res.., 2016, 24, (3), 393.
11) Y. Yokoi, K. Nakamura, T. Yoneda, M. Kikuchi, R. Sugimoto, Y. Shimizu and T. Ayabe, "Paneth cell granule dynamics on secretory responses to bacterial stimuli in enteroids", Sci. Rep.., 2019, 9, 2710.
12) Y.J. Lee, S.R. Han, N.Y. Kim, S.H. Lee, J.S. Jeong and S.W. Lee, "An RNA aptamer that binds carcinoembryonic antigen inhibits hepatic metastasis of colon cancer cells in mice", Gastroenterology., 2012, 143, (1), 155.
13) C. F.O.Hoya, K. Kushiro, Y. Yamaoka, A. Ryo and M. Takai, 'Rapid multiplex microfiber-based immunoassay for anti-MERS-CoV antibody detection', Sens Biosensing Res., 2019,10.1016/j.sbsr.2019.100304.
14) H. Takeuchi, N Sasaki, S. Yamaga, M. Kuboniwa, M. Matsusaki and A. Amano, "Porphyromonas gingivalis induces penetration of lipopolysaccharide and peptidoglycan through the gingival epithelium via degradation of junctional adhesion molecule 1", PLoS Pathog., 2019, 15, (11), e1008124.
15) Y. Yanase, Y. Matsuo, T. Kawaguchi, K. Ishii, A. Tanaka , K. Iwamoto , S. Takahagi and M.Hide, "Activation of Human Peripheral Basophils in Response to High IgE Antibody Concentrations without Antigens"., Int J Mol Med Sci, 2019, 20, (1), 45.
16) M. Yashiro, M. Ohya, T. Mima, Y. Nakashima, K. Kawakami, T. Sonou, K. Tatsuta, Y. Yamano, S. Negi and T. Shigematsu, "Excessive ADAM17 activation occurs in uremic patients and may contribute to their immunocompromised status.", Immun Inflamm Dis., 2020, 10.1002/iid3.298.
17) H Fujishiro, H Yamamoto, N Otera, N Oka, M Jinno and S. Himeno, "In vitro Evaluation of The Effects of Cadmium on Endocytic Uptakes of Proteins into Cultured Proximal Tubule Epithelial Cells.", Toxics, 2020, 8,10.3390/toxics8020024
18) Y. Liu, Y. Liu, X. Zheng, L. Zhao and X. Zhang, "Recapitulating and Deciphering Tumor Microenvironment by Using 3D Printed Plastic Brick–Like Microfluidic Cell Patterning", Adv Healthc Mater, 2020, 9, (6), 1901713.

よくある質問

Q Labeling Kitで1次抗体を直接標識する利点を教えてください。: A

はじめて抗体標識をされる方を対象としたプロトコルを作成しております。
カスタマーサポートの視点から直接標識法の利点や実施例等を記載しておりますので、ご参照下さい。

下記リンクよりダウンロード可能です。
「はじめての抗体標識プロトコル　～カスタマーサポートの視点から～」

Q サンプル溶液中の共存物は反応に影響しますか？

共存物の種類により影響することがあります。
溶液中にどのような物質が含まれるかを確認の上、状況に応じてラベル化に用いるサンプルの精製を行い、標識反応にご使用ください。

＜高分子：分子量1万以上＞
影響する可能性があります。
BSAやゼラチンなどアミノ基をもつ化合物が含まれると、抗体への標識効率が低下します。また、高分子のためFiltration Tubeでも除くことができません。また、アミノ基を持たない化合物でも、高分子の不純物が多いとフィルターの目詰まりの原因になり、標識・精製操作に支障がでる可能性もあります。反応に使用する前に別途除去操作を行ってください。
＊本製品に限らず他のLabeling kit に関しても同様の注意が必要です。

抗体の精製について、小社抗体精製キット（下記）を用いたBSAとゼラチンの除去方法をご紹介いたします。

IgG Purification Kit – A　　　IgG Purification Kit – G

【BSAの除去方法】

1)必要な試薬

IgG Purification Kit-A(もしくはG)(Code：AP01もしくはAP02)

市販の抗体 200µg

2)精製方法

IgG Purification Kit添付の取扱説明書に従って、精製を行う。

【ゼラチンの除去方法】
A, Bいずれかの方法で除去する。

A.コラーゲナーゼ（Collagenase）によるゼラチン分解

抗体・タンパク質標識キット Fluorescein Labeling Kit - NH2　

図1 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: ゼラチン含有IgG溶液
2: 精製後のIgG溶液

(1) 試薬
・コラーゲナーゼ（Sigma, #C7826） 3.5 CDU/ml 希釈溶液
・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02）
・市販の抗体 200 μg
(2)精製方法
・0.2% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlに酵素処理用緩衝液 (100 mmol/l HEPES, pH7.4, 0.36 mmol/l CaCl2含有) 420 μlと酵素処理用緩衝液で調製した 3.5 CDU/ml コラーゲナーゼ希釈溶液 80 μlを加えて混合する。
・37℃、3時間インキュベートした後、IgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※IgG Purification Kitでは、抗体を固定化担体に保持させる際の抗体溶液量を一回当たり200 μlとしている。しかし、上記操作でコラーゲナーゼ処理した抗体溶液量は、約1.5 mlとなるため、IgGを担体に保持させる操作を8回（200 μl×7, 100 μl×1）に分けて行う。
※上記の方法で得られる抗体の回収率：45～50%

B. 300K 限外ろ過チューブを用いたゼラチン除去

抗体・タンパク質標識キット Fluorescein Labeling Kit - NH2　

図2 ゼラチン除去精製前後のSDS-PAGE
1: IgG
2: ゼラチン含有IgG溶液
3: 300K限外濾過のみのIgG溶液
4: 300K限外濾過+ IgG Purification Kit – Gで精製後のIgG溶液

(1)試薬
・300K フィルトレーションチューブ（Pall社ナノセップ遠心ろ過デバイス（製品コード：OD300C33）
・IgG Purification Kit-A(もしくはG) (Code: AP01もしくはAP02）
・市販の抗体 200 μg
(2)精製方法
・0.1% ゼラチンを含む200 μg/ml IgG溶液 1 mlを300K フィルトレーションチューブ 2本に分けて限外ろ過を行う（200 μl×2, 100 μl×1, 13,500 x g）。
・その後、回収溶液500 μlをIgG Purification Kit-A(もしくはG)を用いてIgGを単離する。
※回収溶液500 μlに対し、IgG Purification KitのWashing Buffer 50 μlを添加し、精製を行う。ゲルへの吸着操作は5回繰り返す。
※上記の方法で得られる抗体の回収率：35～45%

Q 低分子のタンパク質（分子量50,000以下）に標識する場合の方法を教えて下さい。: A

キット付属のフィルトレーションチューブは分画分子量30Kの限外濾過フィルターのため、余裕をもって50,000以上のタンパク質のご使用を推奨しております。

分子量50,000以下のタンパク質を標識される場合は、下記のような分画分子量の小さい限外濾過フィルターに変更して頂くことで、低分子のタンパク質でもラベル化可能でございます。

——————————————
PALL社　ナノセップ　 3K　製品No.OD003C33
PALL社　ナノセップ　10K　製品No.OD010C33
——————————————

キット同梱のフィルターを用いた場合に比べ遠心に時間を要することがございますので遠心時間はご検討下さい。

Q 標識後、フィルトレーションチューブを遠心してもメンブレン上に液が残る。: A

（１）メンブレンを目視で確認した際、メンブレンカップの淵にうっすら液が残る程度であれば、次の操作に進んで下さい。
メンブレン上に液が残っていたり、メンブレンカップを傾けて回転させたとき、液が垂れてくるようであれば、さらに遠心を8,000g で15分～30分程度行って下さい。

（２）1)の遠心操作後もメンブレン上に液が残る場合は、標識体が凝集していないか確認してください。
抗体やタンパク質自身の性質によりますが、低分子標識剤を標識することで抗体やタンパク質の疎水性が増し、凝集する場合がございます。
標識体に凝集が見られる場合は、一度別のマイクロチューブに移し、遠心し上澄みをご使用ください。(抗体・タンパク質の回収量は低下いたします。)

上記でも解決しない場合は、小社カスタマーサポートまでお問い合わせください。

※フィルターの目詰まりが疑われる場合は、メンブレンフィルターを新しいものに交換すると解決する場合がございます。
代替品：　PALL社製　ナノセップ　30K (メーカーコード：OD030C33)

Q このキットではどのようなものが標識できますか？: A

分子量が「50,000以上」で反応性のアミノ基(NH₂)を有している化合物(抗体、蛋白質など)であれば標識できます。
量は「50～200μg」が対象となります。

＊キットに添付しているFiltration Tubeのサイズが30Kのため、低分子の化合物は精製できません。

Q モル吸光係数から標識率を算出する時に [0.22]がかけてありますが、この数値は何でしょうか？: A

Fluorescein は280nmと500nmに吸収があり、280nm/500nmの比が[0.22]です。

Fluoresceinの標識率の式は下記の通りです。

60,000は500nmでのFluoresceinのモル吸光係数で、右辺の分子はFluoresceinのモル数になります。

280nmの吸光度は「タンパク質の吸光度＋Fluoresceinの吸光度」となっていますので、500nmの吸光度に0.22を掛けたもの引くことにより、タンパク質のみの吸光度が求まります。
この吸光度をモル吸光係数で割ることで、分母はタンパク質のモル数となります。